分子生物学实验

1、分子生物学实验第1页，共14页，2022年，5月20日，9点59分，星期一 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。 利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。 在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基

2、因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 第2页，共14页，2022年，5月20日，9点59分，星期一不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、P

3、CR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。本实验以动物肝脏为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 第3页，共14页，2022年，5月20日，9点59分，星期一提纯的思路基因组DNA的特性：分子量较大、易断（如何保证DNA分子的完整性？）2. 组织和细胞的破碎3. 要去除的物质： 蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质 第4页，共14页，2022年，5月20日，9点59分，星期一一、材料 哺乳动物新鲜组织。 二、设备 移液管高速冷冻离心机台式离心机水浴锅。 第5页，共14页，2022年，5月20日，9点59分，星期一三、试剂：1. 组织匀

4、浆液 200 mL 灭菌备用 10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 25mmol/L EDTA 100mmol/L NaCl2. 酶解液 100 mL （灭菌后再加蛋白酶K和SDS) 20mmol/L Tris-HCl pH 8.0 50mmol/L EDTA 200mmol/L NaCl 200ug/mL蛋白酶K 1SDS 第6页，共14页，2022年，5月20日，9点59分，星期一3. 生理盐水(0.7%) 1000 mL 灭菌备用4. 3mol/L NaAc pH5.2 100 mL 灭菌备用 先用50mL水溶解固体NaAc 再用3mol/L乙酸调pH至5.2，最后定容同时灭

5、菌备用：枪头： 1mL 、200uL 各一盒小指管: 2.0、0.5mL各20个研磨棒: 20支无菌水：250ml X 2瓶第7页，共14页，2022年，5月20日，9点59分，星期一四、实验步骤 基因组DNA的提取：0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入2mL匀浆液混匀匀浆液转入2mL小指管，40C , 5000rpm离心2min,沉淀加0.4mL无菌水，吹散，再加0.4mL酶解液，慢慢颠倒混匀550C 水浴酶解过夜或2小时以上，40C存放第8页，共14页，2022年，5月20日，9点59分，星期一（加RNase ,终浓度200ug/mL，370C保温60mi

6、n）加等体积酚/氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10-20min40C，10000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清上清加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀40C,10000rpm，用扩口枪头取上清第9页，共14页，2022年，5月20日，9点59分，星期一上清加1/10体积的NaAc和加2倍体积的无水乙醇慢慢混匀沉淀DNA，-200C静置30min，DNA沉淀形成白色絮状物。 12000rpm离心15min，弃上清沉淀用1mL 75%冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心10min，弃上清超净台中干燥加 50uL TE, 40C溶解过夜，-200C保存第10页，共14页，2022

7、年，5月20日，9点59分，星期一基因组DNA的检测 前述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。 1. DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA的含量和质量。 () 2. 取2-5l 在0.7% agarose胶上80V电泳, 检测DNA的分子大小。 () 3. 取2g DNA, 用10单位(U)Hind酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全

8、酶解(做RFLP, DNA必须完全酶解)。 第11页，共14页，2022年，5月20日，9点59分，星期一 如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理： （1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2）酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。 （3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。 （4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。 第12页，共14页，2022年，5月20日，9点59分，星期一可能的结果：由于基因组DNA比较难溶、且容易被降解，电泳时经常会出现弥散的或不均一的条带（如左图）。所以实验时一定要注意机械力对大分子DNA的破坏作用，如避免振荡、使用扩口枪头等。另外