原核基因表达调控模式

1、第七讲原核基因表达调控模式 华锐学院理工系华锐学院分子生物学课件8/25/2022 基因表达(gene expression)是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经转录、翻译等一系列过程，合成特定的物质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。对这个过程的调节就称为基因表达调控（gene regulation或gene control）。 生物学意义：适应环境、维持生长和增殖；维持个体发育和分化。8/25/2022高进勇8/25/2022高进勇原核生物和真核生物都能够根据周围环境(如温度、营养成分等)的变化，改变自己的代谢方式。而代谢方式的变化通常可以通过对基因表达过程的调控得以实

2、现。机体可以在基因表达过程的任何阶段进行调控，一般以转录水平上的调控为主。8/25/2022高进勇原核生物细胞的基因和蛋白质种类较少，如大肠杆菌基因组约为4.60106bp共有4 288个可以框架。据估计，一个细胞中总共含有107个蛋白质分子。如果每个基因等同翻译的话，任何一个多肽应有2 500拷贝。但是，这些蛋白质并不是以相同拷贝数存在于每个细胞中的，有些蛋白质的数目相当固定，另一些则变化很大。8/25/2022高进勇每个大肠杆菌细胞有约15 000个核糖体，50种核糖体蛋白、糖酵解体系的酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等都是代谢过程中必需的，其合成速率不受环境变化或代谢状态的影响，这一类蛋白

3、质被称为永久型（constitutive）合成的蛋白质。8/25/2022高进勇另一类则被称为适应型或调节型（adaptive or regulated），因为这类蛋白质的合成速率明显地受环境的影响而改变。如大肠杆菌细胞中一般只有15个-半乳糖苷酶，但若将细胞培养在只含乳糖的培养基中，每细胞中这个酶的量可高达几万个分子。8/25/2022高进勇7.1.1基因表达调控的基本概念顺式作用元件：对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同在一个DNA分子上的基因；顺式作用元件通常不编码蛋白质，多位于基因旁或内含子中。如启动子、终止子、操纵基因等。7. 1 原核基因表达调控总论8/25/2

4、022高进勇反式作用因子：通过扩散自身表达产物（酶、调节蛋白）控制其他基因的表达,反式作用因子通常为的蛋白质或RNA。如调控蛋白、转录因子等。基因表达的调控主要通过反式作用因子和顺式作用元件相互识别、相互作用而实现。8/25/2022高进勇转录因子（transcription factor ）是转录起始过程中RNA聚合酶所需要的辅助因子。转录因子是参与正调控的反式作用因子，在无转录因子时，RNA聚合酶不能起始转录。转录因子通常识别位于基因上游启动子附近的顺式作用元件。8/25/2022高进勇基因表达调控主要表现在以下二方面：转录水平上的调控(transcriptional regulation

5、)；转录后水平上的调控（post-transcriptional regulation），包括（1）mRNA加工成熟水平调控（differential processing of RNA transcrpt）；（2）翻译水平调控（differential translation of mRNA）。8/25/2022高进勇 基因调控的指挥系统也是多样的，不同的生物使用不同的信号来指挥基因调控。原核生物中，营养状况(nutritional status)和环境因素(environment factor)对基因表达起着举足轻重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平和发育阶段是基因表达调控的

6、最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。8/25/2022高进勇 在转录水平上对基因表达的调控决定于DNA的结构、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。细菌的转录与翻译过程几乎发生在同一时间间隔内，转录与翻译相耦联（coupled transcription and translation）。真核生物中，转录产物（primary transcript）只有从核内运转到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质。8/25/2022高进勇8/25/2022高进勇原核生物的基因调控主要是转录调控，包括负转录调控和正转录调控。在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor）

7、，阻止结构基因转录。根据其作用特征又分为负控诱导和负控阻遏两大类。7.1.2原核基因的调控分类8/25/2022高进勇在负控诱导系统中，阻遏蛋白不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录；在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。阻遏蛋白作用于操纵区。8/25/2022高进勇在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋自(activator)。也可根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导系统和正控阻遏系统。在正控诱导系统中，效应物分子(诱导物)的存在使激活蛋白处于活性状态；在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态。8/25/2022高进勇细菌中的转录调控体系：(a)负

8、控诱导体系； (b)正控诱导体系8/25/2022高进勇细菌中的转录调控体系：(c)负控阻遏体系； (d)正控阻遏体系8/25/2022高进勇 参与大肠杆菌中基因表达调控最常见的蛋白质可能是 因子，基因组序列分析后发现至少存在六种 因子 。除54外，因子在结构上具有同源性，统称70家族，含有4个保守区，其中第2个和第4个保守区参与结合启动区DNA，第2个保守区的另一部分还参与双链DNA解开成单链的过程。8/25/2022高进勇 大肠杆菌中的因子(以70为例)主要包括四个结构域。8/25/2022高进勇54因子识别并与DNA上的-24和-12区相结合。70启动子只有在核心酶结合到DNA链上之后才

9、能与启动子区相结合，而54则类似于真核生物的TATA区结合蛋白（TBP），可以在无核心酶时独立结合到启动子上。8/25/2022高进勇70 （上）和54 （下） 因子识别并结 合在所调控基因上游的不同区域。8/25/2022高进勇7.1.3 原核基因调控的主要特点 原核生物通过特殊代谢物调节基因活性主要分为可诱导调节和可阻遏调节:1.可诱导调节 是指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。这类基因中最突出的例子是大肠杆菌的乳糖操纵子。8/25/2022高进勇大肠杆菌在含有葡萄糖的培养基中生长良好，在只含乳糖的培养基中开始时生长不好

10、，直到合成了能够利用乳糖的一系列酶，具备了利用乳糖作为碳源的能力才开始生长。8/25/2022高进勇细菌获得这一能力的原因就是因为在诱导物乳糖的诱导下启动了乳糖操纵子，表达它所编码的3个酶:-半乳糖苷酶使乳糖水解为半乳糖和葡萄糖)，-半乳糖苷透过酶(使乳糖进入细菌细胞内)，-半乳糖苷乙酰基转移酶(使-半乳糖第六位碳原子乙酰化)。因此，这类基因被称为可诱导基因，这类酶被称为诱导酶，这个生物化学过程被称为酶的诱导合成。8/25/2022高进勇 2.可阻遏调节 这类基因平时都是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。比如大肠杆菌生活中必须

11、有色氨酸，一般情况下，该操纵子是开启的。如果在细菌培养基中加入色氨酸，使之能利用培养基中的色氨酸来维持生活而不需要再费力去合成，细菌往往能在2-3 min内完全关闭该操纵子。8/25/2022高进勇这就是说，某一代谢途径最终产物合成酶的基因可以被这个产物本身所关闭。这种基因被称为可阻遏基因，这些酶被称为可阻遏酶，这个现象被称为可阻遏现象，这些起阻遏作用的小分子被称为阻遏物。在这里，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程(而不是诱导过程)中起作用。8/25/2022高进勇7.1.4 弱化子对基因活性的影响在这种调节方式中，起信号作用的是有特殊负载的氨基酰-tRNA的浓度，在色氨酸操纵子中就是色

12、氨基酰-tRNA的浓度。当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段核苷酸被称为弱化子。这种因为核糖体在基因转录产物上的不同位置，决定了RNA可以形成哪一种形式的二级结构，并由此决定基因能否继续转录的调节方式确实是非常巧妙的。8/25/2022高进勇葡萄糖存在的情况下，即使在细苗培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢这些糖的酶来，这种现象称为葡萄糖效应或降解物抑制作用。出现这种效应的原因是添加葡萄糖后，细菌所需要的能量便可从葡萄糖得到满足，葡萄糖是最方便的能源，细菌无需开启一些不常用的基因去利用这些稀有的糖类。7.1.

13、5 降解物对基因活性的影响8/25/2022高进勇葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸环化酶活性，减少环腺苷酸cAMP的合成，与它相结合的蛋白质环腺苷酸受体蛋内(CRP)又称分解代谢物激活蛋白(CAP)，因找不到配体而不能形成复合物。降解物抑制作用是通过提高转录强度来调节基因表达的，是一种积极的调节方式。8/25/2022高进勇细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿时，即氨基酸的全面匾乏。为了紧缩开支，渡过难关，细菌将会产生一个应急反应，包括生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止。实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸(pppGpp)。产生这两种

14、物质的诱导物是空载tRNA。7.1.6 细菌的应急反应8/25/2022高进勇当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的tRNA，这种空载的tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成，其浓度可增加10倍以上。 ppGpp的出现会关闭许多基因，当然也会打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急状况。8/25/2022高进勇1961年，Jacob和Monod提出了细菌基因表达调控的模型操纵子学说，解释了原核生物的基因表达在转录水平上是如何调控的。操纵子：是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵基因受调节基因产物的控制。7. 2 乳糖操纵子与负

15、控诱导系统8/25/2022高进勇（一）操纵子(operon)的基本组成结构基因、调节基因、操纵基因、启动子、终止子lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI8/25/2022高进勇 (1)结构基因(structural gene)是编码蛋白质或RNA的一段DNA序列。结构基因编码大量的功能各异的蛋白质。特点：（1）含有2个以上的基因（2）各结构基因串连排列，组成结构基因群lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI8/25/2022高进勇（3）多个结构基因的DNA被转录成多顺反子mRNA（4）每个结构基因是一个连续的开放读框（5）至少在第一个开放读框5侧具有核糖

16、体结合位点(RBS)，核糖体识别并结合 ，起始翻译。UAAAUGAUGUAA.38/25/2022高进勇(2)调节基因（regulatory gene） （a）概念： (regulator gene)仅指参与其他基因表达调控的RNA和蛋白质的编码基因。lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacImRNA8/25/2022高进勇（b）调控蛋白类型： 阻遏蛋白（repressive protein）与操纵元件结合后能减弱或阻止所调控基因转录的调控蛋白。 激活蛋白（activating protein）与操纵元件结合后能增强或启动所调控基因转录的调控蛋白。8/25/2022高进勇(3)

17、操纵基因(operator gene )通过与调节基因编码的阻遏子结合或脱离而控制结构基因的转录与否的核苷酸序列。位于结构基因附近，本身不能转录成mRNA。lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI8/25/2022高进勇4、启动子(promoter) 是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。（1）-10序列- Pribnow盒：TATAAT；（2）-35bp序列：TTGACA操纵子至少有一个启动子，一般在第一个结构基因5上游，控制整个结构基因群的转录8/25/2022高进勇5、终止子（terminator） 是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列（1

18、）不依赖因子的终止子 （2）依赖因子的终止子在一个操纵元中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子 8/25/2022高进勇lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI(二)乳糖操纵子（1）组成：5种元件由1个调节基因，3个结构基因、控制元件、启动子和终止子组成。8/25/2022高进勇8/25/2022高进勇1、结构基因（1）lacZ：编码 -半乳糖苷酶 （使乳糖水解）（2）lacY：编码 -半乳糖苷透过酶 （使 -半乳糖苷透过细胞壁、质膜进入细胞内）（3）lacA：编码 -半乳糖苷乙酰转移酶 （将乙酰基转移到 -半乳糖苷上）2、启动子： Plac：控制 lacZ, la

19、cY, lacA；多顺反子的mRNA3、终止子8/25/2022高进勇4、调节基因lacI：编码阻遏蛋白（repressive protein）亚基 四聚体存在时具有活性，与 Olac具有 很强的亲和力。lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacI8/25/2022高进勇5、控制元件 Olac （1）28bp的回文结构，可形成十字形结构 （2）这种结构正好与由四个相同亚基组成的阻遏蛋白相匹配。8/25/2022高进勇lac操纵子主要成分分析8/25/2022高进勇-50-30-1010130-20-4020lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacImRNA（三）乳

20、糖操纵子的负调控培养基不含乳糖 lacZ、 lacY 、 lacA低表达8/25/2022高进勇（三）乳糖操纵子的负调控1、阻遏蛋白与操纵元件结合2、阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合 3、转录不能进行4、lacZ， lacY 、lacA低表达8/25/2022高进勇lacZlacYlacAPlacIPlacOlaclacImRNA Inducer（异构乳糖）lactose分解lactose（四）乳糖操纵子与负控诱导系统培养基含乳糖 -lacZ 等高表达8/25/2022高进勇（四）乳糖操纵子与负控诱导系统1、阻遏蛋白与异构乳糖结合2、阻遏蛋白构象变化，不能与操纵子序列结合3、RNA聚合

21、酶与lac启动子结合4、lacZ， lacY ， lacA的转录可顺利进行8/25/2022高进勇7. 2. 1 酶的诱导lac体系受调控的证据一般情况下，lac+基因型大肠杆菌细胞内-半乳糖苷酶和透过酶的浓度很低，每个细胞只有12个酶分子。但是，在乳糖培养基上酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，超过105个酶分子/细胞。8/25/2022高进勇在无葡萄糖有乳糖的培养基中，lac+细菌中将同时合成-半乳糖苷酶和透过酶。用32P标记的mRNA与模板DNA进行定量分子杂交，表明培养基中加入乳糖12分钟后，编码-半乳糖苷酶和透过酶的lac mRNA量就迅速增加，去掉乳糖后，lac mRNA量立

22、即下降。8/25/2022高进勇 lac体系的“开-关”特性 加入乳糖以后，1min内出现lac mRNA，稍后即产生-半乳糖苷酶和透过酶。当移去乳糖后， lac mRNA总量立即下降，两种酶活性却由于蛋白质半衰期较长而在相当长时期内维持恒定。8/25/2022高进勇实验室常用两种乳糖类似物异丙基巯基半乳糖苷（IPTG）和巯甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用发色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因为它们都不是半乳糖苷酶的底物，所以又称为安慰性诱导物（ gratuitous inducer）。8/25/2022高进勇8/25/2022高进勇用35S标记大肠杆菌细胞（培养基中没有半乳糖），

23、将这些带有放射性的细菌转移到不含35S的培养基中，加入诱导物后-半乳糖苷酶便开始合成。分离纯化-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S标记，说明这种酶是加入诱导物后新合成的。8/25/2022高进勇7. 2. 2 操纵子模型及其影响因子Jacob和Monod认为诱导酶（他们当时称为适应酶）现象是个基因调控问题，而且可以用实验方法进行研究，他们通过大量实验及分析，建立了现在已经被人们广泛接受的乳糖操纵子的控制模型。8/25/2022高进勇 lac操纵子调控模型8/25/2022高进勇A. Z、Y、A基因产物由同一条多顺反子mRNA分子所编码。B. 该mRNA分子的启动区（P）位于阻遏基因（I）与操纵区（

24、O）之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达。C. 操纵区是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。8/25/2022高进勇D. 当阻遏物与操纵区相结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制。E. 诱导物通过与阻遏物结合，改变其三维构象，使之不能与操纵区相结合，诱发lac mRNA的合成。8/25/2022高进勇培养基中有无诱导物对lac mRNA及-半乳糖苷酶活性的影响8/25/2022高进勇阻遏物lac I基因产物及功能lac操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下永久型合成的，该阻遏蛋白有4个相同的亚基，每个亚基均含有347个氨基酸残基，并能与1分子IPTG结合

25、，每个细胞中有510个阻遏物分子。8/25/2022高进勇-半乳糖苷酶在乳糖代谢中的作用是把前者分解成葡萄糖及半乳糖。如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac操纵子。8/25/2022高进勇当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时，lac 启动子表达受阻，没有-半乳糖苷酶活性；当葡萄糖消耗以后(图中箭头处)，细胞内cAMP浓度增加， -半乳糖苷酶活性增加，一度停止生长的细胞又恢复分裂。8/25/2022高进勇某大肠杆菌突变体，它不能将葡萄糖-6-磷酸转化为下一步代谢中间物，该细菌的lac基因能在葡萄糖存在时被诱导合成。所以，不是葡萄糖而是它的某些降解产物抑制la

26、c mRNA的合成，科学上把葡萄糖的这种效应称之为代谢物阻遏效应（catabolite repression）。8/25/2022高进勇 cAMP与代谢物激活蛋白cAMP是在腺苷酸环化酶的作用下由ATP转变而来的，在真核生物的激素调节过程中也起着十分重要的作用。将细菌放在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的浓度就低；如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，cAMP的浓度就会很高。8/25/2022高进勇环腺苷酸化学式8/25/2022高进勇 大肠杆菌中的代谢物激活蛋白，由Crp基因编码，能与cAMP形成复合物。CRP和cAMP都是合成lac mRNA所必需的，cAMP-CRP是一个不

27、同于阻遏物的正调控因子，而lac操纵子的功能是在这两个相互独立的调控体系作用下实现的。8/25/2022高进勇gal，lac和ara操纵子上游启动子区与CRP-cAMP结合位点的相对位置分析8/25/2022高进勇半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇等在降解过程中均转化成葡萄糖或糖酵解途径中的其他中间产物，这些糖代谢中有关的酶都是由可诱导操纵子控制的，被称为降解物敏感型操纵子(catabolitesensitive operon)，由cAMP-CRP调控。8/25/2022高进勇大肠杆菌lac操纵子启动区CRP-cAMP及-35区，-10区序列分析。8/25/2022高进勇cAMP-CRP复合物与

28、启动子区的结合是lac mRNA合成起始所必需的，因为这个复合物结合于启动子上游，能使DNA双螺旋发生弯曲，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。阻遏物则是一个抗解链蛋白，阻止形成开放结构，从而抑制RNA聚合酶的功能。8/25/2022高进勇CRP-cAMP 与上游DNA位点结合后造成模板DNA沿对称序列中央发生90的弯曲8/25/2022高进勇附：葡萄糖水平CRP的关系 CRP只有与cAMP结合才有活性，而cAMP 受葡萄糖水平的控制。 葡萄糖含量高- cAMP水平低 葡萄糖含量低- cAMP水平高8/25/2022高进勇7. 2. 3 lac操纵子的调控区域P、O区P区（即启动子

29、区）一般是从I基因结束到mRNA转录起始位点下游5-10bp，而O区（即阻遏物结合区）位于-7+28位，该区的碱基序列有对称性，其对称轴在+11位碱基对。8/25/2022高进勇不同操纵子启动区及O区相对位置的比较。8/25/2022高进勇7. 3 色氨酸操纵子与负控阻遏系统色氨酸是构成蛋白质的组分，一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸。一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵子(trp operon)的调控。8/25/2022高进勇大肠杆菌中trp操纵

30、子8/25/2022高进勇7.3.1 色氨酸操纵子的结构8/25/2022高进勇7.3.2. 阻遏蛋白的负调控 合成色氨酸所需酶类的基因E、D、C、B、A等头尾相接串连排列组成结构基因群，受其上游的启动子Ptrp和操纵子O的调控，调控基因trpR的位置远离P-O-结构基因群，在自身的启动子作用下，以组成性方式低水平表达分子量为47000的调控蛋白R，R并没有与O结合的活性，当环境能提供足够浓度的色氨酸时，R与色氨酸结合后构象变化而活化，就能够与O特异性亲和结合，阻遏结构基因的转录。8/25/2022高进勇 因此色氨酸操纵子属于一种负性调控的、可阻遏的操纵子（repressible operon

31、），即这操纵子通常是开放转录的，有效应物（色氨酸为阻遏剂）作用时则阻遏关闭转录。细菌不少生物合成系统的操纵子都属于这种类型，其调控可使细菌处在生存繁殖最经济最节省的状态。8/25/2022高进勇当缺乏色氨酸时,该操纵子开放表达阻遏物当存在色氨酸时，该操纵子关闭8/25/2022高进勇7.3.3. 弱化子及其作用 实验观察表明：当色氨酸达到一定浓度、但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生色氨酸合成酶类的量已经明显降低，而且产生的酶量与色氨酸浓度呈负相关。仔细研究发现这种调控现象与色氨酸操纵子特殊的结构有关。8/25/2022高进勇在色氨酸操纵子PO与第一个结构基因trpE之间有162

32、bp的一段前导区（leading sequence，L），实验证明当色氨酸有一定浓度时，RNA聚合酶的转录会终止在这里。 这段序列中含有编码由14个氨基酸组成的短肽的开放阅读框，其序列中有2个色氨酸相连，在此开放阅读框前有核糖体识别结合位点（RBS）序列，提示这段短开放阅读框在转录后是能被翻译的。8/25/2022高进勇前导序列 trp L (leader sequence) :在trp mRNA 5端trpE基因的起始密码前一个长162bp的mRNA片段。起着随色氨酸浓度升高降低转录的作用；弱化子(attenuator) ：也称内部终止子， DNA中可导致转录过早终止的一段核甘酸序列（123

33、-150bp）。弱化作用(attenuation) ：弱化子控制RNA聚合酶通读弱化子能力的调控机制。8/25/2022高进勇弱化子8/25/2022高进勇 mRNA前导区序列分析 trp前导区的碱基序列已经全部测定， 发现完整的前导序列可分为1、2、3、4区域，这四个区域的片段能以两种不同的方式进行碱基配对。8/25/2022高进勇色氨酸操纵子的转录与翻译调控8/25/2022高进勇 有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3方式互补配对。核糖体经过前导区继续翻译的能力控制着这两种结构的转换，它决定mRNA是否形成终止所需的结构。前导序列的终止区与一般的转录终止位点特点相同，具有成串的 U和潜

34、在的能形成茎环的二重对称结构。8/25/2022高进勇 通过RNaseT1降解实验（此酶不水解配对的RNA）表明纯化的trp前导序列中只有1-2和3-4的配对方式。由此定位的3-4配对区正好位于终止密码子识别区，当这个区域发生破坏自我碱基突变，有利于转录的继续进行。 8/25/2022高进勇 转录的弱化理论认为，mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的，在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，在翻译时对tRNATrp的浓度十分敏感。当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的tRNATrp也少，由此推断，翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区

35、（或停留在两个相邻的色氨酸密码子处），8/25/2022高进勇 这时的前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将色氨酸操纵子中的结构基因全部转录完毕为止。测定结果发现，在缺乏色氨酸时所有的RNA聚合酶都能经过弱化子继续参与转录。加上取消阻遏增加的约70倍的表达，总表达量可增加约700倍。8/25/2022高进勇8/25/2022高进勇色氨酸浓度低时1、tRNAtrp-色氨酸供给不足，核糖体遇到色氨酸密码子时就停顿2、在4区转录未完成时，2区和3区就形成发夹结构3、3区和4区不能形成发夹结构（终止信号），导致转录通读；RNA聚合酶继续沿DNA移动，完成结构基因

36、的转录8/25/2022高进勇 当培养基中色氨酸浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对，3-4区可以自由配对形成茎-环式的终止子结构，使得只有约10的RNA聚合酶能继续参与色氨酸操纵子结构基因的转录。8/25/2022高进勇色氨酸操纵子衰减作用机制8/25/2022高进勇色氨酸浓度高时1、tRNAtrp-色氨酸供给充足，核糖体迅速通过色氨酸密码子到达2区2、3区和4区形成发夹结构（终止信号）3、衰减作用发生，转录终止，RNA聚合酶释放，不能完成结构基因的转录8/25/2022高进勇 由此可见，弱化子对RNA聚合酶转录的终止依赖

37、于前导肽翻译中核糖体所处的位置，而细胞中色氨酸存在与否，决定了mRNA 转录的弱化子结构，使弱化子中1、2、3、4区域呈现竞争性配对，从而产生弱化效应，这是色氨酸操纵子第二水平调控的机制。应该指出，色氨酸含量变化对阻遏过程和弱化过程的作用方向是相同的。前者主要控制操纵子基因表达的启动，而后者主要决定转录和翻译是否能继续进行下去。8/25/2022高进勇弱化子作用8/25/2022高进勇8/25/2022高进勇8/25/2022高进勇为什么需要阻遏体系？ 当大量Trp 存在时，阻遏系统起作用。阻抑蛋白与之结合，阻止先导mRNA合成。为什么需要弱化系统？ 当trp浓度低时，阻抑蛋白从有活性变为无活

38、性，速度极慢，不能很快引发trp 合成。因此需要一个能快速作出反应的系统，以保持培养基中适当的Trp水平。8/25/2022高进勇 两个调控系统，避免浪费提高效率； 阻遏系统 高水平trp时，不转录 低水平trp时，转录至前导序列 弱化系统 细调 原核生物细致的精细调控机制，增强原核生物对环境的适应性8/25/2022高进勇衰减作用和负控阻遏的关系1、负控阻遏系统和衰减作用同样对色氨酸水平应答2、衰减作用使色氨酸操纵子结构基因的转录被 抑制了10倍（细调）；3、色氨酸阻遏蛋白的阻遏作用使转录被抑制了70倍（粗调）；4、色氨酸水平对色氨酸操纵子结构基因的表达施加了700倍的调节效果。8/25/2

39、022高进勇7.4 转录水平上的其他调控方式 转录过程涉及转录机器附着于DNA，识别启动子序列，起始RNA的合成，延伸和终止。转录的任何一步都受到调控，其中某些步骤是主要的调控点，比如RNA转录的起始相对延伸和终止来说。自然选择使得生物的调控策略达到最优化。转录过程的调节是生物基因表达调节最有效的方式。8/25/2022高进勇7.4.1 因子的调节作用 不同的 因子可以独立地起作用。但是，为了保证细胞准确响应不同的环境信号变化， 因子之间常常交互作用构成网络调控模式。使得原核基因的表达稳定而平衡。 因子本身的活性受到蛋白水解酶的调控，也能被同源的抗因了失活。这些抗因子能够与特定的 因子结合，阻

40、止它们与RNA聚合酶的组装。8/25/2022高进勇F的两种存在形式8/25/2022高进勇7.4.2 转录调控因子的作用 能够与基因的启动子区相结合，对基因的转录起激活或抑制作用的DNA结合蛋白被称为转录调控因子。大肠杆菌基因组中有300多个基因编码这样的蛋白质，它们大多数是序列特异性的DNA 结合蛋白，能够与特定的启动子结合。有些能够调控大量基因的表达，而有些仅调控一两个基因的表达。8/25/2022高进勇7.4.3 抗终止因子的调节作用 抗终止因子是能够在特定位点阻止转录终止的一类蛋白质。当这些蛋白质存在时，RNA聚合酶能够越过终止子，继续转录DNA。这种基因表达调控机制主要见于噬菌体和

41、少数细菌中。在RNA聚合酶到达终止子之前与RNA聚合酶结合、因为在终止子上游存在抗终止作用的信号序列，只有与抗终止因子相结合的RNA聚合酶才能顺利通过具有茎环结构的终止子，使转录继续进行。8/25/2022高进勇抗终止子通读作用(a)开始转录 (b)缺少抗终止因子 (c)存在抗终止因子8/25/2022高进勇 参与大肠杆菌抗终止作用的蛋白是NusA蛋白。转录起始不久，因子从RNA聚合酶上解离下来， NusA 蛋白就结合到了核心RNA聚合酶上。 NusA 的结合增加了RN A聚合酶在终止子发夹结构处暂停的过程，从而促进抗终止子作用的发生。8/25/2022高进勇NusA 和 因子不能同时结合到R

42、NA聚合酶上。只要RNA聚合酶结合在DNA上， NusA就不会从RNA聚合酶上解离，而因子可以取代游离RNA聚合酶上的NusA ，因此，在转录起始和终止的过程中RNA聚合酶分别受到因子和NusA的调控。8/25/2022高进勇7. 5 转录后调控7. 5. 1 翻译起始的调控遗传信息的翻译起始于mRNA上的核糖体结合位点（RBS）-起始密子AUG上游的一段非翻译区。在RBS中有SD序列，与核糖体16S rRNA的3端互补配对，促使核糖体与mRNA相结合。RBS的结合强度取决于SD序列的结构及与AUG之间的距离。SD与AUG之间相距一般以410核苷酸为佳，9核苷酸最佳。8/25/2022高进勇R

43、BS8/25/2022高进勇SD sequenceAUG10basesUAAGGAGGU:complementary with 16s rRNA58/25/2022高进勇翻译一个顺反子需要二级结构的改变，而这种二级结构的改变又依赖于前一个顺反子的翻译。mRNA上有多个核糖体存在时，第一个顺反子的翻译会破坏mRNA原有的二级结构，使核糖体能够与下一个顺反子的翻译起始区域结合。7.5.2 mRNA的二级结构对翻译起始的调控8/25/2022高进勇8/25/2022高进勇7.5.3 调节蛋白的调控作用 细菌中有些mRNA结合蛋白可激活靶基因的翻译。大肠杆菌BipA蛋白就其有依赖于核糖体的ATP酶活性

44、，能够激活转录调控蛋fis mRNA的翻译，是fis蛋白质合成所必需的。8/25/2022高进勇 相反，mRNA特异性抑制蛋白则通过与核糖体竞争性结合mRNA分子来抑制翻译的起始。大肠杆菌中核糖体蛋白就存在翻译抑制现象。rRNA基因正常的转录和翻译将产生核糖体蛋白，由于这些蛋白与rRNA分子的亲和力较强，只要细胞有足够的rRNA分子，核糖体蛋白就不会结合到自身mRNA分子上。当细胞中缺乏足够的mRNA分子时，核糖体蛋白只能结合到自身mRNA分子上，导致该mRNA的RBS位点被封闭，蛋白质合成停止。8/25/2022高进勇核糖体蛋白对自身mRNA翻译的抑制作用8/25/2022高进勇7.5.4

45、反义RNA的调节作用反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子, 也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式，最早是在E.coli 的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现的,许多实验证明在真核生物中也存在反义RNA。 8/25/2022高进勇 RNA调节是原核生物基因表达转录后调节的另一种重要机制。细菌响应环境压力(氧化压力、渗透压、温度等)的改变，会产生一些非编码的小RNA分子，能与mRNA中的特定序列配对并改变所配对mRNA分子的构象，

46、导致翻泽过程被开启或者关闭。也可能导致目标mRNA分子的快速降解。8/25/2022高进勇反义RNA调控的可能机制1、和靶核苷酸序列形成双链区，直接阻碍其翻译的起始。2、在靶分子的部分区域形成双链区，易成为内切酶的底物，使与其结合的mRNA变得不稳定3、反义RNA也可与转录物结合并装扮成一个终止子，使转录提前结束8/25/2022高进勇7.5.5 稀有密码子对翻译的影响实验证据RNA引物由dnaG基因编码的引物酶催化合成dnaG、rpoD及rpsU属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子。基因转录出来的三个蛋白相应的mRNA拷贝数大体相同，由于翻译的调控使得蛋白的拷贝数发生了很大的变化。8/25/2022高进勇8/25/2022高进勇由于细胞内对应于稀有密码子的tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。8/25/2022高进勇许多调控蛋白如LacI、AraC、TrpR等在细胞内含量很低，这些基因中密码子的使用频率与dnaG相似。科学家