细胞色素C的制备和测定实验原理及步骤

1、实验2 细胞色素C的制备和测定目的要求（1）通过细胞色素C的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤。（2）掌握制备细胞色素C的操作技术及含量测定方法。原理细胞色素是包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中。细胞色素是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C（Cytochrome C）只是细胞色素的一种。它主要存在于线粒体中，需氧最多的组织如心肌及酵母细胞中，细胞色素C含量丰富。细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，分子量约为1300，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成。它溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可自酸性水中提取，制品可分为氧化型和还原型两种，前

2、者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸、碱都比较稳定，但高浓度三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。本实验以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。试剂和器材一、材料猪心。二、试剂2mol/L H2SO4溶液，1mol/L NH4OH（氨水）溶液，0.2%NaCl溶液，25%（NH4）2SO4溶液（100ml溶液中含25g（NH4）2SO4，约为25时40%的饱和度），BaCl2试剂（称BaCl212g溶于100ml蒸馏水中），20%三氯乙酸（TCA）溶液，人造沸石（Na2OAl2O3xSiO2yH2O）

3、；白色颗粒，不溶于水，溶于酸。选用6080目，联二亚硫酸钠（dithionite，Na2S2O42H2O）。三、器材绞肉机，电磁搅拌器，电动搅拌器，离心机。72型分光光度计，玻璃柱（2.530cm），500ml下口瓶，烧杯（2，000ml，1，000ml，500ml，400ml，200ml各一个），量筒，移液管，玻璃漏半，玻璃搅棒，透析纸，纱布。操作方法一、材料处理新鲜或冰冻猪心，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小块，放入绞肉机中绞碎。二、提取称取心肌碎肉50g，放入100ml烧杯中，加蒸馏水100ml。用电动搅拌器搅拌，加入2mol/L H2SO4，调pH至4.0（此时溶液呈暗紫色），在

4、室温下搅拌提取1h。用1mol/LNH4OH调pH至6.0，停止搅拌。用数层纱布压挤过滤，收集滤液，滤渣加入75ml蒸馏水，按上述条件重复提取1h，两次提取液合并（为减少学时，可只提取一次，也可改过滤为离心，离心条件为3500rpm，10min。）。三、中和用1mol/L NH4OH将上述提取液调pH至7.2，静置适当时间后离心（3500rpm，10min），所得红色滤液通过人造沸石柱吸附。四、吸附人造沸石容易吸附细胞色素C，吸附后能被25%硫酸铵溶液洗脱下来，利用此特性将细胞色素C与其他杂蛋白分开。具体操作如下：称取人造沸石3.5g，放入烧杯中，加水后搅动，用倾渲法除去12s内不下沉的细颗粒

5、。剪裁大小合适的一块圆形泡沫塑料，安装入干净的玻璃柱底部，将柱架至垂直，柱下端连接乳胶管，用夹子夹住，向柱内加蒸馏水至2/3体积，然后将预处理好的人造沸石装填入柱，避免柱内出现气泡。装柱完毕，打开柱下端夹子，使柱内沸石面上剩下一薄层水。将中和好的澄清滤液进入下口瓶，使之沉柱壁缓缓流入柱内，进行吸附，流出液的速度约为5ml/min。随着细胞色素C的被吸附，人造沸石逐渐由白色变为红色，流出液应为淡黄色或微红色。五、洗脱吸附完毕，将红色人造沸石自柱内取出，放入烧杯中，先用自来水，后用蒸馏水洗涤至水清，再用20ml 0.2%NaCl溶液分3次洗涤沸石，再用蒸馏水洗至水清，重新装柱，也可在柱内，用同样方

6、法洗涤沸石，然后用25%硫酸铵溶液洗脱，流速控制在2ml/min以下，收集红色洗脱液（洗脱液一旦变白，立即停止收集），洗脱完毕，人造沸石可再生使用。六、盐析为了进一步提纯细胞色素C，在洗脱液中，继续慢慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使硫酸铵溶液浓度为45%（约相当于67%的饱和度），放置30min以上（最好过夜），杂蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的细胞色素C滤液。七、三氯乙酸沉淀在搅拌下，每100ml细胞色素C溶液加入2.55.0ml20%三氯乙酸，细胞色素C沉淀析出，立即以3000r/min的转速离心15min，倾去上清液（如上清液带红色，应再加入适量三氯乙酸，重复离心），收集沉淀的细胞色素

7、C，加入少许蒸馏水，用玻璃棒搅动，使沉淀溶解。八、透析将沉淀的细胞色素C溶解于少量蒸馏水后，装入透析袋，放进500ml烧杯中（用电磁搅拌器搅拌），对蒸馏水透析，15min换水一次，换水34次后，检查是否已被除净。检查的方法是，取2ml BaCl2溶液放入一支普通试管，滴加23滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示未除净，如果无沉淀出现，表示透析完全。将透析液过滤，即得清亮的细胞色素C粗品溶液。九、含量测定本实验方法制备的细胞色素C是还原型和氧化型的混合物，因此在测定含量时，要加入联二亚硫酸钠，使混合物中的氧化型细胞色素C变为还原型。还原型细胞色素C水溶液在波长520nm处有最大吸收值，根据这

8、一特性，用国产722型分光光度计选一标准品，作出细胞色素C浓度和对应的光吸收值的标准曲线，然后根据所测溶液的光吸收值，由标准曲线的斜率求出所测样品的含量。具体操作如下：细胞色素C的含量=A*（81/25）*（1/4）*0.870*V（我们测的数据：10倍稀释，A=0.10、0.018、0.003）取1ml标准品（81mg/ml），用水稀释至25ml，从中取0.2,0.4,0.6,0.8和1.0ml，分别放入5支试管中，每管补加蒸馏水至4ml，并加少许联二亚硫酸钠作还原剂，然后在520nm波长处测得各管的光吸收值分别为0.179，0.350，0.520，0.700和0.870，以上述经稀释25倍

9、标准样品的毫升数或计算得到的浓度值（mg/ml）为横坐标，A值为纵坐标，作出标准曲线图（图26.1），从而求得斜率为1/3.17。1.000.800.600.400.20 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 ml 细胞色素C含量的测定标准曲线取样品1ml，稀释适当倍数（本实验稀释25倍），再取此稀释液1ml，加水3ml，再加少许联二亚硫酸钠，然后在波长520nm处测得A值为0.312和0.344，其平均值为0.343。根据此A值查标准曲线，得细胞色素C浓度，再计算其样品原液浓度，或根据标准曲线斜率计算样品原液浓度。细胞色素浓度=0.34325=0.3433.7125=31.81mg/ml在本实验中，每500g猪心碎肉，应获得75mg以上的细胞色素C粗制品。也可以用如下方法测定粗品液浓度：取已知浓度的细胞色素C标准液1ml与样品样品液1ml，按上述方法分别测得A520nm值（调节二者浓度，使A值在0.20.7范围）。根据标准液浓度和它的A值，计算样品液浓度和粗品总量。注意事项（1）力争除尺猪心非心肌组织，如脂肪、血管、韧带和积血。（2）提取、中和要注意调节pH。吸附、洗脱应严格掌握流速。（