微生物4-10章8.6菌种保藏

1、1 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染；c）死亡；第六节 菌种保藏2一、菌种的退化与复壮1、菌种退化是指随着菌种保藏时间的延长或菌种的多次转接传代，菌种发生变异使其本身所具有的优良的遗传性状发生劣化或某些遗传标记的丢失的现象。常见的菌种退化现象：菌落形态改变：如菌落颜色的改变；细胞形态改变：如畸形细胞的出现；菌种的生理改变：如菌株生长变得缓慢，产孢子越来越少直至产孢子能力丧失；例如放线菌、霉菌在斜面上多次传代后产生“光秃”现象等，从而造成生产上用孢子接种的困难；菌种的代谢改变：代谢产物的生产能力或 其对寄主

2、的寄生能力明显下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗菌素发酵单位的减少，枯草杆菌产淀粉酶能力的衰退等。 32、菌种退化的原因 菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。当控制产量的基因发生负突变，就会引起产量下降；当控制孢子生成的基因发生负突变，则使菌种产孢子性能下降。 4菌种退化是从量变到质变的过程 开始时，在群体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采用有效措施而一味移种传代，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，最后占优势，从而使整个群体表现出严重的退化现象。传代次数越多退化越明显：突变在数量上的表现依赖于传代，即菌株处于一定条件下，群体多次繁殖，可使退化细胞在数量上逐渐占优势，于是退化

3、性状 的表现就更加明显，逐渐成为一株退化了的菌体。旺盛生长的细胞突变率高于休眠细胞：对某一菌株的特定基因来讲，突变频率比较低，因此群体中个体发生生产性能的突变不是很容易的，但就一 个经常处于旺盛生长状态的细胞而言，发生突变的机率比处于休眠状态的细胞大得多，因此，细胞的代谢水平与基因突变关系密切，应设法控制细胞保藏的环境，使 细胞处于休眠状态，从而减少菌种的退化。 53、防止退化的措施 合理的育种选育菌种时所处理的细胞应使用单核的，避免使用多核细胞； 合理选择诱变剂的种类和剂量或增加突变位点，以减少分离回复；在诱变处理后进行充分培养及分离纯化，以保证保藏菌种纯粹。63、防止退化的措施 合理的育种

4、选用合适的培养基用老苜蓿根汁培养基培养“5406”抗生菌细黄链霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌产生菌藤仓赤霉的培养基中，加入糖蜜、天门冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物质时，也有防止菌种退化的效果。选取营养相对贫乏的培养基做菌种保藏培养基，如培养基中适当限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因为变异多半是通过菌株的生长繁殖而产生的，当培养基营养丰富时，菌株会处于旺盛的生长状态，代谢水平较高，为变异提供了良好的条件，大大提高了菌株的退化几率。 73、防止退化的措施 合理的育种选用合适的培养基创造良好的培养条件在生产实践中，创造和发现一个适合原种生长的条件可以防止菌种退化。在栖土曲霉3942的培养中

5、，有人曾用改变培养温度的措施（从20-30提高到33-34）来防止它产孢子能力的退化。 83、防止退化的措施 合理的育种选用合适的培养基创造良好的培养条件控制传代次数由于微生物存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生而表现出来的。所以应尽量避免不必要的移种和传代，把必要的传代降低到最低水平，以降低自发突发的机率。菌种传代次数越多，产生突变的几率就越高，因而菌种发生退化的机会就越多。不论在实验室还是在生产实践上，必须严格控制菌种的移种传代次数，并根据菌种保藏方法的不同，确立恰当的移种传代的时间间隔。如同时采用斜面保藏和其它的保藏方式（真空冻干保藏、砂土管、液氮保藏等），以延长菌种保藏时间。 9

6、3、防止退化的措施 合理的育种选用合适的培养基创造良好的培养条件控制传代次数利用不同类型的细胞进行移种传代在有些微生物中，如放线菌和霉菌，由于其菌的细胞常含有几个核或甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就没有这种现象发生。有人在实践中发现构巢曲霉如用分生孢子传代就容易退化，而改用子囊孢子移种传代则不易退化；还有人采用灭过菌的棉团轻巧地沾取“5406”孢子进行斜面移种，由于避免了菌丝的接入，因而达到了防止退化的效果。 103、防止退化的措施 合理的育种选用合适的培养基创造良好的培养条件控 制传代次数利用不同类型的细胞进行移种传代采用有效的菌种保藏方法用

7、于工业生产的一些微生物菌种，其主要性状都属于数量性状，而这类性状恰是最容易退化的。因此有必要研究和制定出更有效的菌种保藏方法以防止菌种退化。 114、退化菌种的复壮 菌种的复壮：是指通过纯种分离和性能测定等方法从退化菌种的群体中找出少数尚未退化的个体，以达到恢复菌种的原有典型性状；或在菌种的生产性能尚未退化前就经常而有意识地进行纯种分离和生产性能的测定，以达到菌种的生产性能逐步有所提高，即一种利用自发突变不断从生产中进行选种。 124、退化菌种的复壮菌种的复壮措施：纯种分离：采用平板划线分离法、稀释平板法或涂布法把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能

8、进行性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性状。通过寄主进行复壮：寄生型微生物的退化菌株可接种到相应寄主体内以提高菌株的活力。联合复壮：对退化菌株还可用高剂量的紫外线辐射和低剂量的化学诱变剂（亚硝基胍NTG）联合处理进行复壮。 13二、菌种保藏1、菌种保藏的任务广泛收集在科学研究与生产中有价值的菌种；研究它们的生物学特性研究和采取妥善的保藏方法使菌种不死不污染并尽可能少发生变异编制菌种目录为掌握和利用微生物资源提供依据。 142、菌种保藏的原理选择适宜的培养基培养温度和菌龄以便得到健壮的细胞或孢子保存于低温隔氧干燥避光的环境中尽量降低或停止微生物

9、的代谢活动减慢或停止生长繁殖不被杂菌污染在较长时期内保持著生活能力。 153、菌种保藏的方法由于微生物的多样性，不同的微生物往往对应不同的保藏方法，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。16在一定时间内使菌种不死、不变、不乱。基本要求：基本方法生活态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥3、菌种保藏的方法休眠态17（1）定期移植法 亦称传代培

10、养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，在最适条件下培养，至静止期或产生成熟的孢子时置入 46 的冰箱（或冰库）保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 在培养和保存的过程中由于代谢产物的累积而改变了原菌的生活条件结果菌落群体中的个体就不断衰老和死亡因此每515天 或 14个月重新移植一次具体间隔时间因种而异。凡能人工培养的微生物都可用此法保存。此法不需特殊设备但烦琐费时而且经常移植容易引起菌种退化。18（2）液体石蜡保藏法 亦称矿物油保藏法，是定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的

11、液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（46）进行保存的一种菌种保藏方法。 19操作步骤A、液体石蜡的准备选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，采用以下两种方式进行灭菌：121湿热灭菌30min，置40恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。160干热灭菌2个小时，冷却后，经无菌检查后备用。B、 斜面培养物的制备C、灌注石蜡 将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入培养好的新鲜斜面培养物上，液面高出斜面顶部1cm左右，使菌体与空气隔绝。D、保藏注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（46）干燥处保藏，保藏时间210年。保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡

12、。E、恢复培养恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。20注意事项注入的液体必须不与培养基混溶对菌种无毒不易被利用和挥发。此法适用于酵母菌芽孢杆菌不适用于固氮菌乳酸杆菌明串珠菌法门氏菌和毛霉目中的大多数属种。此法简便易行但必须注意防火和污染。 21（3）沙土管保藏法 是载体保藏法的一种。将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液，注入灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上，将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于46或室温进行保存的一种菌种保藏方法。 22操作步骤A、沙土管制备将河沙用60目过筛

13、，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用10%盐酸浸泡，如河沙中有机物较多可用20%盐酸浸泡。24小时后倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干或晒干。另取地面下4060cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100目过筛,水洗至中性，烘干。将处理后的沙、土按质量比21混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121湿热灭菌30min。随机抽取灭菌后的砂土管若干支，无菌条件下取少许砂土至营养肉汁培养基中，30培养24小时，检查无微生物生长后方可使用。B、斜面培养物的制备C、制备菌悬液向培养好的斜面培养物中注入35mL无菌水，洗下细胞或

14、孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，每管0.20.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。D、干燥：真空抽去沙土管中水分。E、 保藏将沙土管用火焰熔封后存放于低温（46）干燥处保藏，每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。保藏时间210年。F、 恢复培养无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。此法适用于芽孢杆菌梭状芽孢杆菌放线菌镰刀菌等。 23（4）冷冻干燥法 将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，

15、从而长期维持存活状态。 24好氧菌冷冻干燥操作步骤A、 安瓿管准备：安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121下高压灭菌15-20分钟，备用。B、保护剂的选择和准备：保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。C、冻干样品的准备：在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理

16、办公室 文件微生物菌种纯度检测技术规程（试行），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌 为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部 管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于 安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。D、预冻：一般预冻2小时以上，温度达到-20到-35左右。E、

17、 冷冻干燥：采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。F、真空封口及真空检验：将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。G、保藏：安瓿管应低温避光保藏。H、质量检查：冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。25厌氧菌冷冻干燥操作步骤主要程序与需氧菌操作相同，注意保护剂的选择和准备，保护剂使用前应在100的沸水中煮沸15分钟左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。 26复苏方法先用

18、70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。27（5）-80低温冷冻保藏 将菌种保藏在-80冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。 28操作步骤A、安瓿管的准备：安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121下高压灭菌15-20分钟，备用。B、保护剂的选择和准备：保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护

19、剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。C、微生物保藏物的准备：在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后，与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/mL为宜（以大肠杆菌 为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部 管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基

20、，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于 安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。D、冻结保藏：将安瓿管或塑料冻存管置于-80冰箱中保藏。E、复苏方法：从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38-40水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。29（6）液氮超低温保藏 液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196的液态氮，或在-150的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。 30操作步骤A、安瓿管或冻存管的准备：用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净， 121下高压灭菌15-20分钟，备用。B、 保护剂的准备：保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度，一般采用10-20%甘油。C、 微生物保藏物的准备：微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用静止期或成熟期培养物。分装时注意应在无菌条件下操作。D、预冻：预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降1为好、使样品冻结到-35