复方五仁醇胶囊保肝作用的血清药理学研究

1、复方五仁醇胶囊保肝作用的血清药理学研究【摘要】目的：建立复方五仁醇胶囊血清药理学研究方法。方法：建立l4诱导的原代培养大鼠肝细胞损伤模型，大鼠为含药血清供体，以含药血清对损伤肝细胞增殖TT法及丙氨酸氨基转移酶ALT泄漏的影响两个指标，结合含药血清中五味子乙素的含量测定，分别采用单因素考察、多因素的正交试验，优选含药血清的制备方法，并确定体系中血清添加量。结果：每天以成人等效剂量10倍的甲醇提取物间隔8h分两次给正常大鼠灌胃给药，连续3天，末次给药后2h采血制备含药血清比拟合理，体系中参加10%该条件下制备的含药血清能明显进步损伤肝细胞的增殖才能、降低细胞ALT泄漏。结论：适宜条件下制备的复方五

2、仁醇胶囊含药血清对肝细胞损伤具有明显的保护作用，血清药理学研究方法可以用于该制剂的药效评价。【关键词】复方五仁醇胶囊；保肝作用；含药血清；血清药理学Abstratbjetive：Testablishaserupharalgytestingethdfrpundurenhunapsules().ethds：delfl4-induedinjuryfpriaryulturehepatyteasestablishedandratasusedasthednrtprepareseruntaining.ithhepatyteinreent(TT),alanineaintransferase(ALT)inell

3、ultureediuandthententfshisandrininseruasindies,single-fatrinvestigatinandultiple-fatrrthgnalexperienterearriedut,usingserurplasa,andseruntainingdruginulturesystefdifferentnentratinnpharalgialeffetandtsreenfthepreparativeethdfseruntainingdruganditssuitablenentratininulturesyste.Results：Nralratsasthed

4、natrfseru,usingethanliextratf,10tiesequivalentdsefradultseveryday,intragastriadinistratintieadayf8-hurinterval,keepingn3days,hespasiaafter2hursfthelastadinistratinasthebetterpreparativeethdftheseruntainingdrug.Adding10%fthisserutulturesysteuldelevatehepatyteinreentanddepressALTinellultureediusignifi

5、antly.nlusin：Seruntainingpreparedbysuitableethdpssessesanbviusprtetiveeffetninjuredhepatyteandserupharalgyanbeappliedtevaluatedthepharalgialeffetf.Keyrdspundurenhunapsules();Liverprtetin;Seruntainingdrug;Serupharalgy中药“血清药理学是指在动物经口服给药一段时间后采血别离血清，用此含药血清进展体外药理实验的一种实验方法，该方法作为中药研究的新思路和新方法而倍受推崇。复方五仁醇胶囊是我

6、院研制的以五味子为君药的治疗慢性肝炎的科研制剂，我们对该制剂进展了“血清药理学研究的方法学讨论。1材料与方法1.1材料1.1.1动物SD大鼠，SPF级，体重23019.8g，雌雄不拘，由南通大学实验动物中心提供。1.1.2试剂与试药羟乙基哌嗪乙磺酸香港FAR公司；乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸美国ARES公司分装；胶原酶IV美国Siga公司分装；胰蛋白酶美国Siga公司分装；DE培养基美国GIB公司；新西兰新生小牛血清美国Hylne公司；四氯化碳宜兴市第二化学试剂厂；溴化3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑蓝TT，ARES公司；五味子乙素中药固体制剂制造技术国家工程研究中心；复方五

7、仁醇胶囊本院自制。1.1.3仪器HERAell2培养箱德国GbH公司；BI-TEK340酶标仪美国Siga公司；日立7170全自动生化分析仪日本日立公司；Agilent1100Series高效液相色谱仪美国Agilent公司。1.2方法1.2.1大鼠灌胃用药物的处理取复方五仁醇胶囊内容物，加0.5%-Na制成混悬液。另取复方五仁醇胶囊内容物，甲醇回流提取，加0.5%-Na制成混悬液。1.2.2肝细胞的别离与培养按文献1方法别离大鼠肝细胞，并以1105/2接种于96孔及48孔培养板中，置2培养箱5237培养。1.2.3含药血清制备方法考察给药形式及剂量考察取SD大鼠20只，随机分成5组制剂原形组

8、，提取物小剂量、中剂量、大剂量组和空白组，每组4只，禁食12h。制剂原组组每天按照成人临床等效剂量的10倍分两次灌胃制剂混悬液，提取物小剂量、中剂量和大剂量组同法分别灌胃5、10和20的提取物混悬液，连续给药3天，末次给药后1h颈总动脉取血，4过夜，别离血清，空白组每天0.5%-Na灌胃，同法制备空白血清。取培养24小时的肝细胞，吸弃上清液，随机分成6组正常对照组，模型对照组，制剂原形组，提取物小剂量、中剂量、大剂量组，每组设6个复孔。除正常对照组外，每孔参加含l4的DE及相应含药血清模型对照组为空白血清，l4和血清的终浓度分别为10l/L和10，正常组相应参加DE培养液和空白血清。作用24h

9、后，搜集48孔板中培养上清液检测ALT。96孔板中每孔参加5g/l的TT液20l，继续孵育4h，每孔再参加DS200l，振荡后，用酶标仪于波长570n测吸光值A。1.2.4含药血清制备方法考察其他条件的正交试验考察以动物是否造模、给药间隔时间、取血时间、取血成分为考察因素，每个因素设2个程度见表1，选用L8(27)正交表安排试验。取SD大鼠32只，随机分成8组，每组4只，其中肝损伤模型大鼠给药前24h腹腔注射l41.0l/kg。各组每天按照成人临床等效剂量的10倍分两次灌胃提取物混悬液，末次颈总动脉取血，血浆组血液立即离心别离血浆，血清组血液4过夜，别离血清。取培养24h的肝细胞，吸弃上清液，

10、随机分成8组，分别用以上制得的含药血清血浆按1.2.3相应方法处理，测定ALT及吸光值A。按文献方法2制备对照品及含药血清血浆供试品溶液，注入液相色谱仪，测定五味子乙素含量。1.2.5体系中含药血清添加量考察取培养24h的肝细胞，弃上清液，随机分成6组正常对照组，模型对照组，5%、10%、20%、40%含药血清组，每组设6个复孔。模型对照组和各含药血清组更换为参加l410l/L的DE培养液，正常对照组相应参加DE培养基，正常对照组和模型对照组参加终浓度为10的空白血清，各含药血清分别组参加按1.2.4中正交试验1号方案制备的含药血清，使终浓度分别为5%、10%、20%和40%。作用24h后，按

11、1.2.3相应方法处理，测定ALT及吸光值A。转贴于论文联盟.ll.1.2.6统计学方法使用Stata7.0统计软件包进展数据处理。数据以xs表示，用方差分析处理数据。2结果2.1含药血清制备方法考察：给药形式及剂量考察与正常对照组相比，模型对照组TT值显著下降P0.01、ALT显著升高P0.01，说明造模获得成功；与模型对照组比拟，除提取物小剂量组TT值无显著差异外P0.05，其余各试验组TT值均明显升高P0.01或P0.05，ALT明显下降P0.01或P0.05；与提取物中剂量组比拟，等剂量灌胃制备的制剂原形组TT值及ALT差异均无统计学意义P0.05。结果提示，制剂的甲醇提取物与制剂原形

12、具有等效性，且3个剂量组不存在明显的量效关系。故确定以成人临床等效剂量10倍的甲醇提取物给大鼠灌胃制备含药血清。见表2。2.2含药血清制备方法考察：其他条件的正交试验考察将各试验组3个指标的测定结果分别按百分制转换成积分TT、五味子乙素以最高为100，ALT以倒数计算，最高为100，综合加权评分TT、ALT、五味子乙素分别占35%、35%和30%后进展统计分析。结果见表3。方差分析结果显示，因素取血时间对结果有极显著影响P0.01，B因素给药间隔时间有显著影响P0.05，且两者之间存在交互作用B之P0.05，交互作用分析显示最正确组合为B11，血浆的影响优于血清，但无统计学意义P0.05，而动

13、物是否造模几乎没有影响见表4。因此，含药血清制备方法可定为A1B11D1，即每天间隔8h给正常大鼠灌胃给药2次，连续3天，末次给药后2h取血别离血清。2.3体系中含药血清添加量考察与模型对照组比拟，各浓度含药血清组TT值均明显升高P0.01或P0.05，ALT均显著下降P0.01；与10%含药血清组比拟，20%、40%含药血清组TT值明显下降P0.01或P0.05，5%含药血清组无显著差异P0.05，5%、20%、40%含药血清组ALT均明显升高P0.01或P0.05。提示体系中参加10%的含药血清效果最正确见表5。3讨论目前含药血清的制备多数采用药效指标考察，少数考虑化学指标，且无视了各影响

14、因素的交互作用。本课题采用药理和化学指标相结合加权评分的正交试验，发现存在交互作用。理论上讲，宜采用病理状态下的动物制备含药血清3，但是，本研究结果显示，动物是否造模几乎对结果没有影响，与文献报道一致4。有学者提出“血浆药理学优于“血清药理学5，本研究结果显示，血浆与血清对结果的影响虽然没有统计学差异，但直观分析前者优于后者，与先期发现的血浆中药效成分含量高于血清的结果2一致，后续研究应该注意。研究结果显示，含药血清浓度超过一定范围药效反而降低，这可能是由于血清浓度过高会产生一定的细胞毒性6。【参考文献】1徐淑云.药理实验方法学.第3版.北京：人民卫生出版社，2002：581-583.2罗琳，窦志华，丁安伟，等大鼠灌胃复方五仁醇胶囊后血清和血浆中五味子醇甲和五味子乙素的比拟J中草药，2022，3710：1486-1489.3张声鹏，施旭光，桂蜀华关于中药血清药理学中血清供体