数据分析总结报告样板

1、Solexa RNA-Seq数据分析总结地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：1 / 32客户合同号目录一项目信息41.1. 41.2 合同信息4二数据分析52.1 分析流程图52.2 分析内容：62.3 数据分析结果6序列格式展示62.3.1序列估72.3.2数据预处理102.3.32.3.3Mapgenome112.3.4ALL GENE Expres. 132.3.5Differential geneysis142.3.5.1GO enrient182.3.5.2KEGG enrient192.3.6Splicing transcript expres.202.3.7Ne

2、w gene detection202.3.8Alternative splicing detection21地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：2 / 322.3.9new lncRNAysis242.3.10Known lncRNAysis252.3.11Differential lncRNAysis252.3.12 lncRNAprediction262.3.13 TransGO/KEGGysis272.3.14 gene fu. 282.3.15 SNV calling30三、参考文献32地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：3 / 32一 项目信息1

3、.11.2 合同信息地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：4 / 32合同销售信息样本数量客户客户二数据分析2.1分析流程图地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：5 / 32KEGG EnrientGO EnrientNew GeneGene FuDifferential expresAlternative Splicingnovel LncRNAExpresin gene levelExpresranscript levelAlignment with referenceKnown LncRNAClean reads (fastq)SNV callingRaw

4、 reads (fastq)2.2 分析内容：对 2 个样本的(全)转录组数据进行常规转录组分析，包括数据预处理、组 map、表达分析、转录本表达分析、可变剪切分析、差异分析、新查找、差异GO/KEGG 富集分析、融合、SNV 及 LncRAN 分析。注：下面中*表示是 4 样本的代称2.3 数据分析结果序列格式展示2.3.1NGS(Next Generation Sequencing，二代高通量(如：illumina Hiseq 2000/2500、Miseq、Genome)技术应用高通量yzer IIx)对 cDNA 进仪序。首先得到的原始图像文件，然后经过碱基识别及误差过滤，最终得到可以

5、用于分析的原始片段，称之为 Reads，它包括序列的碱基组成信息以及其对应的序列质量信息，双端(pair-end)会分为两个 Reads 文件：_1，_2。Reads 部分截取展示如下：地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：6 / 32序列估2.3.2评估原理：应用质量 Q 值进行评估，Q 值与错误 E 值之间关系为：质量与错误率对照表错误率(E)质量值(Q)5%131%200.1%300.01%40(max Q)地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：7 / 32评估方法：Q 值盒图统计：盒图即是质量分位图，黄色长方形最下面的边为占 25%比例的，质量 Q 值，

6、依此往上分别为占 50%比例，占 75%比例对应的质量 Q 值，上下的黑线代表占 90%和 10%对应的质量值，蓝色的线表示质量数值的平均值、绿色背景部分代表高质量数值部分、橘色背景部分代表合理质量数值部分、红色背景部分代表低质量数值部分。Fig2.3.2.1quality sistics横坐标为 reads 的碱基位置，纵坐标为所有 reads 在每个位置上的质量(Q: 040)分布。此为一个样本双端结果综合示例。地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：8 / 32碱基分布图：可以观测过程碱基均衡性，一般来说，因采用随机引物扩增但随即引物种类有限而导致 reads 的前 10

7、个碱基的比例不均衡，会出现波动是正常现象。在此波动之后的碱基互补配对原理 GC 及 AT 碱基对会分别均衡分布。Fig2.3.2.2Bases distribution横坐标为 reads 碱基位置，纵坐标为碱基所占的比例。不同颜色表示不同碱基。此为一个样本双端结果综合示例。评估结论：所有样本结果优良，碱基分布均衡详细结果详见：istics/*_ qc/ QC_report.html。reads quality s地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：9 / 322.3.3 数据预处理得到 Raw Reads 中可能含有总体质量较低、含有引物、末端质量偏不合格的 Reads，这

8、些不合格的 Reads 很有可能对分析质量造成一定的影响，所以必须对其进行过滤，得到可用于数据分析的 clean Reads，主要过滤步骤如下：1. 去除总体质量偏低的 reads，将质量大于 20 碱基所占比例小于 50%的 reads 去除2. 去除 3端质量 Q 低于 10 的碱基，即碱基错误率小于 0.1，其中，Q=-10logerror_ratio3. 去除 reads 中所含有的接头序列4. 去除 reads 中含有的模糊的 N 碱基，是由于强度不够,机器无法识别的碱基5. 去除长度小于 20 的片段(reads)Clean 统计结果如下：结果统计如下表：Table 2.3.3cl

9、eansumaryA81,240,18079,103,85578,219,81375,630,70293.10%B88,996,29087,035,30086,197,15883,758,72294.11%注：Clean ratio=(Clean reads/Raw reads)%数据量计算方法：81,240,180reads=81M reads=81*100/1000G bases=8.1G bases地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：10 / 32Sle IDRaw readsQuality trimeptor trimedClean readsClean ratio2

10、.3.3Mapgenome应用 tophat(ver:2.0.6)2的 spliced map算法对预处理后 reads 进行Genome map，这种算法允许将不能全长匹配的 reads 分割进行 map，较适用于真核(有内含子间区)转录组数据；比对允许 2 个错配，每个 reads 允许 multi hits=2。Map生成的比对结果为 BAM 文件，见：BAM/*.bam采用组版本为 UCSC mm10，地址为：统计如下表：MapTable2.3.3. mapresult sisticsA75,630,70268,899,57065,497,3103,402,26065,159,7753

11、,739,79591.1%B83,758,72277,222,74174,527,8922,694,84972,919,5234,303,30292.2%注：Mapratio=Mapped reads/All reads, Mapped Multi reads：匹配到组多个位置的reads, Mapped Unique reads：在组仅有一个位置匹配的 reads地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：11 / 32MappedMappedMappedMappedMappedMapSles_IDAll readsPairbroken-pairUniqueMultireadsra

12、tioreadsreadsreadsreadsFig.2.3.3 Regions distribution注：其中 non-coding region 包括 5UTR、3UTR、non-coding RNA regions 等总的非编码区域的统计,详细解释组覆盖分布图：以 1K 的窗口得出组的一个覆盖分布，图中最外圈为组，里面每一个圈表示一个样本的覆盖地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：12 / 32饱和度分析图：横坐标为的数据量纵坐标为覆盖到的比例可以说明数量是否足够2.3.4ALL GENE Expres应用 cufflink(ver:2.0.2)3对 tophat 的

13、map结果进行定量。主要过程为：首先由已有的注释文件得到具置，然后将覆盖到区域的 reads 进行计数，最后应用长度与 reads 计数进行表达量标准化计算。定量标准化公式如下：FPKM 含义：Fragments Per Kilobase of exon mper Million mapped reads，公式如下：其中，transcription_reads 为覆盖整个 geneexon 的 fragment reads 数目transcription_length 为 gene exon 总长度地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：13 / 32FPKM transcrip

14、tion_reads 109 transcription_length total_mapped_reads_in_runtotal_mapped_reads_in_run 为该样本所有 mapped genome 的总 fragment reads 数目注：Fragment=a pair of reads详细定量结果见：gene_expres/gene expres.xlsx.文件字段说明：第一列：名称第二列：EntrezGene ID第三列：描述信息第四列：locus，即，的位置信息，如，chr1:56095-59915：位于chr1 上的56095-59915 这个区段第五，六列：在不同

15、样本中的表达量第七，八列：在不同样本中的 fragments 个数2.3.5Differential geneysis应用 DEGseq包将 2.3.4 归一化得到的 FPKM 值进行样本间差异分析。采用 Fold-change(表达差异倍数)以及 Fisher-test 精确检验统计学方法对差异差异程度进行筛选，挑选条件如下：1).假设检验 FDR =2差异详细信息见：differential gene/*_differential _all.xlsdifferential gene/*_differential_UP.xlsdifferential_gene/*_differential_

16、DOWN.xls地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：14 / 32差异表格文件字段说明：第一列：名称第二列：EntrezGene ID第三列：描述信息第四列：locus，即，差异的位置信息第五、六列：在各样本中的表达量 FPKM第七列：取 log2 对数后的 fold-change 值第八列：统计阈值 p-value，值越小，差异越显著第九列：FDR(False discovery rate control,q-value)，对 p-value 的一个检验，使差异阈值更加可靠，FDR0.05 为差异，FDR=10 的作为新，共找到 256 个新，Ensemble 详见文件：n

17、ew gene/new_gene.fa,new_gene/new_gene.xls。地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：20 / 32文件字段说明：第一列：新ID第二列：ID第三、四列：新起始、终止位置第五列：新的正负链第六七列：新在各样本中的表达量2.3.8Alternative splicing(AS) detection应用 astalavistaver：3.1 (Foissac andSammeth, 2007; Sammeth, 2009;模型，检测可变剪切位点及剪切Sammeth et al., 2008)应用 cufflinks形式，具体算法流程如下：出的地址：

18、市科技园区路 151 号（201203）：传真：21 / 32在生物体内，主要存在 7 种可变剪切类型如下：（a）Skipped exon （SE）:外显子跳跃（b）Alternative 5 splicing stie（A5SS）: 可变 5端剪切（c）Alternative 3 splicing site（A3SS）: 可变 3端剪切（d）Retainedron（RI）:内含子滞留（e）Mutually exclusive exon （MEX）:互相排斥的外显子（f）Alternative promoters（AP）：启动子可变（g）Alternative poly(A) （APA）：po

19、ly(A)可变（o）Complex：多种剪切方式组合剪切类型统计如下：地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：22 / 32可变剪切检测结果详见文件：alternative splicing/astalavista splicing.xls文件格式如下:文件字段说明：第一列：第二列：正负链地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：23 / 32第三列：cufflinks 转录本 ID第四列：转录本两端位置第五列：可变剪切区两端相同侧翼位点第六列：可变剪切模式代码第七列： 可变剪切位点2.3.9new lncRNAysis用 PhyloCSF 流程进行新 lncRNA

20、的定量。LncRNA 筛选条件包括：，再用 RSEM 对的新 lncRNA 进行1) Transcript Length = 200bp2) Transcript ORF 300bp3) 根据已知数据库 conding 和 non-conding 区域建立的氨基酸替换模型，蛋白编码区域氨基同义替换频率低，同义替换频率高，non-conding 区域反之。将 1,2 步得到 transcripts进行多物种比对，通过分析序列多物种比对结果以及替换频率规则评估 transcripts 序列属于conding 和non-conding 的可能性，使用这种可能性比值区别 conding 与non-co

21、nding4) 将第 3 步符合 non-coding 条件的 transcripts 与 Pfam 蛋白功能域数据库进行比对，将具有蛋白功能域的 transcripts 进行排除，最终得出LncRNA transcripts。结果见：lncRNA/new lncRNA anlaysis/new lncRNA expres.xls文件字段说明：第一列：新 lncRNA id第二列：new lncRNA 长度第三列：ID第四、五列：起始、终止位置地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：24 / 32第六列：new lncRNA 的正负链第七八列：new lncRNA 在不同样本中的

22、 fragment reads 覆盖值第九十：new lncRNA 在不同样本中的表达量2.3.10Known lncRNAysis用 RSEM 对已知 lncRNA 进行定量。结果见：lncRNA/known lncRNA ysis/known lncRNA expres.xls文件字段说明：第一列：known lncRNA 信息第二列：known lncRNA 长度第三，四列：known lncRNA 在不同样本中的 fragment reads 覆盖值第五，六列：known lncRNA 在不同样本中的表达量2.3.11Differential lncRNAysis应用 2.3.9 和

23、2.3.10 得到的 FPKM 值进行样本间差异分析。差异挑选条件如下：1).FDR =2*表示比对的两样本差异详细信息见：lncRNA/differential_lncRNA/*_differential_all.xls地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：25 / 32lncRNA/differential_lncRNA/*_differential_UP.xlslncRNA/differential_lncRNA/*_differential_DOWN.xls字段说明：第一列：lncRNA 信息第二列：lncRNA 长度第三、四列：lncRNA 在各样本中的表达量 FPK

24、M第五列：取 log2 对数后的 fold-change 值第六列：统计阈值 p-value，值越小，差异越显著第七列：FDR(False discovery rate control,q-value)，对 p-value 的一个检验，使差异阈值更加可靠，FDR0.05 为差异，FDR0.01 为显著差异2.3.12 lncRNAprediction小鼠 lncRNA 的 trans采用数据库是小鼠 mRNA 数据库。先采用 blast 选择出序列上具有互补性或相似性的序列，再利用 RNAplex 计算两序列之间的互补能量，选择出阈值以上的序列。详细 trans结果见：lncRNA/lncRN

25、A TransPrediction/lncRNA trans predition.xls字段说明：第一列：lncRNA信息第二列：transEntrezGene ID第三列：trans所在和在上的起始终止位置信息第四列：transrefseqid地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：26 / 32第五列：transEvalue 值2.3.13 TransGO/KEGGysis对 2.3.11 的差异 lncRNA 对应的靶进行 GO、Pathway 分析。结果见：1、 差异 lncRNA 对应的 trans的信息见:lncRNA/trans KEGG GO ysis/diffe

26、rential lncRNA transinfo.xls字段说明：第一列：lncRNA信息第二列：transEntrezGene ID第三列：trans所在和在上的起始终止位置信息第四列：transrefseqid第五列：transEvalue 值2、 trans对应的 GO 信息结果见：lncRNA/trans KEGG GO ysis/differential lncRNA transGOinfo.xls字段说明：第一列：transid第二列：GO id第三列：GO term 名称地址：市科技园区路 151 号（201203）：传真：27 / 32第四列：类别第五列：Evidence co

27、de3、 trans对应的KEGG 信息结果见：lncRNA/trans KEGG GO ysis/trans gene2pathway.xls字段说明：第一列：gene id第二列：pathway 信息lncRNA/trans KEGG GO ysis/trans pathway info.xls字段说明：第一列：pathway id第二列：pathway 描述信息第三列：pathway 上的 trans数第四列：pathway 上的 trans列表ysis/pathway 文件夹中为 Pathway 通路图，包括KEGG 中相应的说明页面(图中红色标记的lncRNA/trans_KEGG_GO_网页