细胞分离技术

1、关于细胞分离技术第一张，PPT共六十五页，创作于2022年6月部分微生物胞内酶第一节 细胞分离第二张，PPT共六十五页，创作于2022年6月2胞内重组药物 设计试验，请用生物工程学的原理和方法生产治疗糖尿病的胰岛素？第三张，PPT共六十五页，创作于2022年6月3 分离胞内产物与胞外产物的差别是什么？为回收和提纯胞内产品, 必须先将它们从胞内释放到胞外, 然后进行分离纯化。可以采用分泌性宿主使胞内产物直接分泌到胞外;也可用破碎细胞的方法使其释放出来。第四张，PPT共六十五页，创作于2022年6月4细胞与液体物质的分离又称为固液分离，固液分离方法包括过滤与离心沉降。一、过滤 指利用多孔性介质截流

2、固体悬浮液中的固体颗粒，进行固液分离的方法。 过滤不但是传统的化工单元，而且是目前工业生产中用于分离细胞和不溶性物质的主要方法。第五张，PPT共六十五页，创作于2022年6月5过 滤一般过滤：微生物、动植物细胞膜过滤：蛋白质等物质的选择性分离一般过滤：以压力差作为推动力。第六张，PPT共六十五页，创作于2022年6月6二、离心沉降沉降法：指固体颗粒在外力作用下与液体物质做相对运动最终实现固液分离的技术。沉降法根据作用外力的不同，可分为重力沉降和离心沉降。第七张，PPT共六十五页，创作于2022年6月7离心沉降是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或提取条件。1）

3、离心沉降的原理： 固体和液体之间存在一定的密度差，且固体密度大于液体的密度。2）影响离心沉降速度的因素密度差、颗粒大小、液体粘度、离心力大小第八张，PPT共六十五页，创作于2022年6月8斯托克斯公式：u=d2(s) r2/18 1)密度差越大(s)，离心沉降速度越快；2)固体颗粒尺寸越大，越容易离心;3)液体粘度越大，越不容易离心；4)离心力r2的大小对固液分离影响很大。第九张，PPT共六十五页，创作于2022年6月93） 离心机的分类分离因数 Fr r2g分离因数 Fr 的大小分为1) Fr3000 常速离心机2) Fr 30005 000 中速离心机3) Fr 5000 高速离心机4)

4、Fr=2104106 超速离心机第十张，PPT共六十五页，创作于2022年6月10离心分离法根据其操作方式的不同，又可分为差速离心和密度梯度离心。1) 差速离心法如果所要的蛋白质(或生物大分子)主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等；则可利用差速离心（differential centrifugation）方法将它们分开收集，该细胞组分作为下步纯化的材料。 第十一张，PPT共六十五页，创作于2022年6月11优点：可以一下子除去很多杂蛋白质，使纯化工作容易得多。 如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提

5、取。 第十二张，PPT共六十五页，创作于2022年6月12差速离心法的原理差速离心是利用不同离心速度产生不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分别分开。不同物质有不同的形状、大小、质量和密度，当在介质中离心时，它们的沉降速度各有差异。第十三张，PPT共六十五页，创作于2022年6月13大的颗粒碎片在低速时很快沉降，被分离的物质留在上清液中; 逐步增加离心力，进一步离心上清液，使中等颗粒沉降，最后是大小和密度最小的颗粒沉降。注意：每次得到的沉淀，必须经过几次洗涤后，反复悬浮和离心，才能得到比较纯的部分。 第十四张，PPT共六十五页，创作于2022年6月14差速离心图示第十五张，PPT共六十五页，

6、创作于2022年6月15差速离心的方法为了将细胞中各种组分纯化分离，首先要在等渗缓冲液中把细胞破碎匀浆;然后用差速离心的方法，把匀浆液中的各种组分分离;在离心场中，不同大小的颗粒沉向离心管底部的速率不同。第十六张，PPT共六十五页，创作于2022年6月16差速离心的方法当离心力低，离心时间短时，细胞核即可沉到管底；加大离心力后，又可分离出线粒体；离心力再加大，才能分离出微粒体和核糖体。最后几步的超离心力，可超过地心引力的10万倍以上， 悬液经离心分离出核糖体以后所剩的上清液，则是由细胞原生质的可溶性部分和极微小的颗粒所组成，这些组分则需要更严格的离心方法才能分离出来 第十七张，PPT共六十五页

7、，创作于2022年6月172) 一般密度梯度离心法也称分级区带离心，有：1）蔗糖密度梯度离心2）氯化铯密度梯度离心用于RNA-DNA混合物、核蛋白体亚单位和其他细胞成分的分离第十八张，PPT共六十五页，创作于2022年6月18一般密度梯度离心法：把样品铺放在一个连续的液体密度梯度上，然后进行离心，并控制离心分离的时间，使得粒子完全沉降之前，在液体梯度中移动而形成不连续的分离区带。第十九张，PPT共六十五页，创作于2022年6月19一般密度梯度离心图示第二十张，PPT共六十五页，创作于2022年6月203) 等密度梯度离心法等密度梯度离心法：不同粒子存在密度差时，在离心力场作用下，粒子或向下沉降

8、，或向上浮起，一直移动到与它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）并形成区带，此即等密度梯度离心法。第二十一张，PPT共六十五页，创作于2022年6月21等密度梯度离心法第二十二张，PPT共六十五页，创作于2022年6月22三、离心过滤1）离心过滤的原理以离心力作为推动力完成过滤操作,具有离心和过滤的双重作用。2）影响离心过滤速度的因素 过滤面积和离心力第二十三张，PPT共六十五页，创作于2022年6月23离心过滤机可分离固体密度大于或小于液体密度的悬浮液。可分为: 连续式离心机和间歇式离心机。第二十四张，PPT共六十五页，创作于2022年6月24第二节 细胞破碎细胞破碎：指选用物理，化学，酶或

9、机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。第二十五张，PPT共六十五页，创作于2022年6月25一、细胞壁结构细胞壁化学组成非常复杂, 取决于微生物类型细胞的年龄细胞的生长生理学多糖，脂质，蛋白质在三维结构上的排列方式第二十六张，PPT共六十五页，创作于2022年6月26细胞壁的结构第二十七张，PPT共六十五页，创作于2022年6月27二、细胞破碎率破碎率： 被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分数。1）直接记数法2）间接记数法第二十八张，PPT共六十五页，创作于2022年6月281）直接记数法平板计数技术需时长；只有活细胞才能计数；会产生误差血球细胞器上用显微镜计数快速而简单，但细胞小计数困难第二十九张

10、，PPT共六十五页，创作于2022年6月292）间接记数法在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（如可溶性蛋白，酶等）。将破碎后的细胞悬液离心去掉固体（完整细胞和碎片），然后对上清液进行含量或活性分析。酶活性是破碎程度的很好指示参数。第三十张，PPT共六十五页，创作于2022年6月30三、细胞破碎的方法破碎方法机械法非机械法固体剪切作用液体剪切作用珠磨法压榨法高压匀浆超声破碎酶溶法化学法物理法第三十一张，PPT共六十五页，创作于2022年6月311）珠磨法（图3-6）作用机理： 微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混匀，珠子之间及珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，促使细胞壁

11、破裂，释放出内含物。第三十二张，PPT共六十五页，创作于2022年6月32影响因素：转盘转速：破碎比速度与转盘速度成正比。细胞浓度：最佳浓度应由实验确定。浓度大，产生的热量大，但单位细胞重量所消耗的功率小。珠粒大小：在一定范围内，磨珠越小，破碎速度越快，但也不能过小。第三十三张，PPT共六十五页，创作于2022年6月33温度：将温度控制在540对破碎物影响较小。流量：流量大，加工单位质量细胞消耗的能量减小，但细胞的破碎程度和蛋白质的释放量会降低。第三十四张，PPT共六十五页，创作于2022年6月34 温控与能耗珠磨机是采用夹套冷却的方式实现温度控制的，一般情况下能将温度控制在要求的范围内；珠磨

12、机的能耗与细胞破碎率成正比；高的破碎率会提高分离的成本。第三十五张，PPT共六十五页，创作于2022年6月352) 高压匀浆法（图3-8）作用机理 从高压室压出的细胞悬浮液，经过阀座的中心孔道从阀座和阀杆之间的小环隙中喷出，速度可达几百米每秒。这种高速喷出的悬液又射击到静止的碰撞环上，被迫改变方向从出口管流出。第三十六张，PPT共六十五页，创作于2022年6月36 温控与能耗活性物质在破碎过程中的失活问题。 蛋白质和酶的失活主要由匀浆过程中产生的热引起。如果能将温度控制在35C以下，酶失活的损失可以忽略。提高压力有利于细胞破碎，但需增加能耗。 机械破碎的能耗主要包括提供动力消耗的能量及低温操作

13、消耗的能量。第三十七张，PPT共六十五页，创作于2022年6月373) 超声波法作用机理 声频高于1520KHz的超声波在高强度声能输入可以引起空化现象，使气泡形成、胀大和破碎的现象。第三十八张，PPT共六十五页，创作于2022年6月38此法多适用于微生物材料、细胞培养材料的破碎；因超声波处理时产热较多，故应用此法时，需要采取降温措施；另外，某些核酸及酶对超声波敏感，慎用此法。 第三十九张，PPT共六十五页，创作于2022年6月39超声波破碎过程效率的影响因素：声频声能处理时间细胞浓度菌种类型第四十张，PPT共六十五页，创作于2022年6月40四) 化学渗透法 用化学药品改变细胞壁或膜的通透性

14、，从而使内含 物有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法。作用机理 化学渗透取决于化学试剂的类型及细胞壁和膜的结构与组成。不同试剂对各种微生物细胞作用的部位和方式有所差异。第四十一张，PPT共六十五页，创作于2022年6月41有机溶剂（苯、甲苯）表面活性剂有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）表面活性剂处理法使细胞膜破坏。 金属螯合剂（EDTA）变性剂（盐酸胍、脲）第四十二张，PPT共六十五页，创作于2022年6月42五) 酶溶法 用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。 溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、 -1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶等。第四十三张

15、，PPT共六十五页，创作于2022年6月43作用机理 溶酶具有高度专一性，蛋白酶只能水解蛋白质，葡聚糖酶只能水解葡聚糖，因此，利用溶酶系统处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的使用次序。第四十四张，PPT共六十五页，创作于2022年6月44酶溶法的优点：产品释放的选择性高抽提的速率和收率高产品的破坏最少对pH和温度等外界条件要求低不残留细胞碎片第四十五张，PPT共六十五页，创作于2022年6月45六) 物理法渗透压冲击法反复冻融法多用于动物细胞。将细胞在-20以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 低温玻璃化法

16、 指从超微结构上损伤细胞，使细胞壁、细胞膜等成分遭受破坏。第四十六张，PPT共六十五页，创作于2022年6月46各种破碎方法的比较及选择分类具体方法优缺点及适用范围机械破碎法珠磨法破碎率高，适用范围广，但后处理复杂高压均浆法破碎率高，可大规模操作，适用范围小超声波破碎适用于实验室小规模操作物理破碎法冻融法操作简便，但不适用于对冷冻敏感的细胞低温玻璃化成本高，适用于实验室小规模生产化学渗透法加入特定化学试剂选择性高，细胞碎片大，后处理容易；但作用时间长，适用范围小酶溶法加入酶选择性高，细胞碎片大，后处理容易；但成本高，适用范围小第四十七张，PPT共六十五页，创作于2022年6月47细胞破碎技术的

17、发展方向多种破碎方法相结合与下游过程相结合破碎过程要易于细胞碎片的除净。与上游过程相结合培养基、生长期、操作参数等。第四十八张，PPT共六十五页，创作于2022年6月48第三节 胞内产物的溶解及复性一、包含体及其形成二、包含体的分离和溶解三、蛋白质复性第四十九张，PPT共六十五页，创作于2022年6月49（一）包含体及其形成 1) 包含体的概念 在基因工程菌细胞内表达的重组蛋白，常常互相交联在一起，形成不溶性的聚积物，通常称为包含体。第五十张，PPT共六十五页，创作于2022年6月50包含体在相差显微镜下呈现为许多个高度折光的颗粒，含有这些包含体的大肠杆菌的菌体变大，并出现突起部分。在电镜下，

18、包含体是无明显的膜存在，大致为圆形，直径可达1微米。包含体第五十一张，PPT共六十五页，创作于2022年6月51包涵体存在于包含体内的重组蛋白通常无生物活性，其形成与否取决于蛋白质的类型。含有二硫键的真核生物蛋白质，在原核生物中进行表达，常常因重组蛋白内及分子间二硫键的错配，而产生无活性的蛋白质，成为不溶性的物质。第五十二张，PPT共六十五页，创作于2022年6月52包含体形成的原因产生少量蛋白时，可溶，量过多时，在细胞内超过其溶解度而沉淀；蛋白质合成速度太快，肽链来不及形成正常的折叠构象，导致分子间因疏水作用聚合而不溶，生物活性受影响；第五十三张，PPT共六十五页，创作于2022年6月53高

19、表达的蛋白没有形成正常的二硫键，或宿主细胞内氧化还原等条件不同而生成不同的-S-S-；蛋白的溶解需要与其他成分结合或经其他成分诱导形成适当的可溶性构象，当产生的蛋白量过多，所需其他成分相对不足，如折叠酶，分子伴侣等。第五十四张，PPT共六十五页，创作于2022年6月54包含体的形成亦与蛋白质自身稳定性有关。第五十五张，PPT共六十五页，创作于2022年6月55二、包含体的分离和溶解包含体存在于细胞质中，其分离：破碎细胞（如高压匀浆，或超声波处理，或溶菌酶等）离心（5000-20 000 r/min，15min）得到包含体沉淀第五十六张，PPT共六十五页，创作于2022年6月56包含体的溶解1)溶解常用试剂:尿素盐酸胍去污剂SDS2)二硫键的还原剂:二硫基苏糖醇(DTT)2-巯基已醇破坏蛋白质的高级结构破坏肽链之间的疏水作用使二硫键处于可逆断裂状态第五十七张，PPT共六十五页，创作于2022年6月57三、 蛋白质复性正确构象的形成需要进行变性和复性 在结构上：使伸展的肽链成为特定的三维结构； 在功能上：