普通生物化学笔记上

1、普通生物化学笔记(上篇)绪论重点:生物化学的概念、研究内容；生物化学的研究发展简史；生物化学与分子生物学及各专业的关系。（一）生物化学的概念、研究内容概念：生物化学(Biochemistry)介于生物与化学之间的边缘学科，研究活细胞和有机体中存在的各种化学成分及其所参与的化学反应，是基础的一门科学。命现象化学研究内容：静态生物化学：生物体的基本物质（生物大分子糖类、脂类、蛋白质、核酸）的结构、性质及结构与功能的关系。动态生物化学：的基本化学成分在生命活动过程中的变化规律（物质代谢和能量代谢）。生物体信息生物化学：包括核酸的生物的调控等。，蛋白质的生物质代谢与表达现物化学与分子生物学研究的重点和

2、热点：功能组学（functalgenomics）；蛋白质组学（proteomics）；细胞信号转导（signal transduct等。（二）生物化学的研究发展简史）准备和酝酿阶段（18c 中期-20c 初）：物体的化学组成建立与发展阶段(20c 初-20c 中叶)：重要分子的发现和物质代谢途径的确定深入发展阶段(20c 中叶-20c 末)：分子生物学时期黄金时期（本世纪初）：后组时期我国科学家的贡献：1965 年，人工全生物活性结晶牛胰岛素：1981 年，人工具有生物活性的酵母丙氨酰 tRNA：参与了人类组计划（1%）等等。（三）生物化学与分子生物学及各专业的关系分子生物学（Molecula

3、r Biology）：生物化学学科的重要组成部分,是从分子水平认识和命现象的科学。生物学各学科：生物化学是生物学各学科的最基础的学科，生物化学的进步极大地推动了生物学各学科的发展。化学是学习生物化学不可缺少的基础课程。随着生物学研究的深入，物理学、数学及信息学也渗透到生物化学中。蛋白质化学重点：蛋白质组成、结构、性质及蛋白质的结构与功能的关系；蛋白质的分离、纯化和鉴定。蛋白质：基础.生物体的基本成分，生命活动的执行者,生命的物质蛋白质的生物学功能：生物催化；代谢调节；免疫保护；物质转运和与支持；生长、繁殖、遗传和变异；生物膜的功能和受体等。；运动蛋白质的分类：组成：单纯蛋白质和结合蛋白质肽链数

4、目：单体蛋白质和寡聚或多体蛋白质功能:非活性蛋白(保护或支持作用)和活性蛋白溶解度：可溶性蛋白质（水、稀中性盐和稀酸溶液）、醇溶性蛋白质（7080%乙醇）和不溶性蛋白质分子形状：状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白。(一) 蛋白质的结构一、蛋白质的元素组成：C（5055%）、H（68%）、O（2023%）、N（1518%）、 S（04%）、Se 等，其中氮元素的含量平均约 16%凯氏（Kjadehl）定氮法：每克样品含氮克数6.25100=100g 样品中的蛋白质含量(g%)。二、蛋白质的结构 氨基酸 (amino acid)氨基酸：蛋白质的基本组成。蛋白质氨基酸：编码氨基酸（标准氨基酸或基本氨基酸：

5、20 种）和非编码氨基酸（非标准氨基酸）1、氨基酸的结构通式：（1）C结合（-NH3+）、（-COOH）、H 原子和各种侧链（R）（Pro 除外）；（2）C是不对称 C，具有手性（Gly 除外），蛋白质氨基酸都是 L-型。2、氨基酸的分类：来源（内源和外源）；营养学（必需和非必需 ）；侧链（R）。根据R 的化学结构：（1）脂肪族氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Arg、Lys、Aslu、Asn、Gln、Ser、Thr；（2）芳香族氨基酸： e、Tyr；（3）杂环氨基酸：Tris；（4）杂环亚氨基酸：Pro。根据R 的极性：（1）非极性、疏水性氨基酸：R 为烃基、苯

6、甲基等非极性基团（Gly,Ala,Val,Leu,Ile,e,Pro）；（2）极性、中性氨基酸：R 为羟基 (Ser,Thr,Tyr)、巯基(Cys,Met)、酰胺基(Trp,Asn,Gln)等极性基团；（3）极性、酸性氨基酸(Aslu)；（4）极性、碱性氨基酸(Lys 、 Arg 、 His)。胱氨酸和二硫键3.氨基酸的理化性质(1).一般物理性质：无色或白色结晶，200，不同味道；氨基酸均可溶于强酸、强碱和水，不溶于。(2).两性电离性质： 氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在，在同一个氨基酸分子上带有能解离出质子的NH3+正离子和能接受质子的COO-负离子，为两性电解质。结合或

7、质子取决于环境。(Isoelectric po)：在一定环境下，氨基酸游离成阴、阳离子的程度及)，在电场中既不向阳极也不向阴极迁移时的趋势相等或为兼性离子(Zwitter值。等电点的确定：酸碱滴定（滴定曲线）；根据值（等电点等于两性离子两侧值的算术平均数）。(3).紫外吸收性质：Trp、Tyr 和峰。e 含共轭双键苯环，在 280nm 处有最大吸收(4).化学性质:-NH2、-COOH 和R 侧链的活性基团可发生相关化学反应。1）-NH2 发生的化学反应与反应:氨基酸-NH2 与反应生成二羟甲基氨基酸。滴定法：测定氨基酸含量。与 2,4-二硝基氟苯(DNFB 或 FDNB)反应：Sanger

8、反应，-NH2 的 H 原子被烃基取代的烃基化反应，在碱性中生成二基氨基酸（黄色）。可用于 N 端分析。与 5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）反应：-NH2 的H 原子被酰基取代的酰基化反应，在碱性中生成 5-二甲氨基萘磺酰氨基酸（DNS-氨基酸：荧光）。取代 DNFB 测定蛋白质 N 端氨基酸，用于多肽分析。与异硫酸苯酯（TC）反应：Edman 降解,-NH2 的 H 原子被烃基取代的烃基化反应，在碱性中生成苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），无水 HF 中生成苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸：无色）。重复测定多肽链 N 端氨基酸排列顺序，是氨基酸自动分析的基础。脱氨基反应：生物体内氨

9、基酸分解代谢的重要方式之一。2）-COOH 发生的化学反应成酯和成盐反应：羧基的化学性质被掩蔽，氨基的化学性质突出地显示出来。成酰氯反应：氨基酸的羧基活化，易与另一氨基酸的氨基结合。成酰胺反应：Aslu）转化成Asn（Gln）。脱羧反应：生物体内氨基酸分解代谢的重要方式之一。3）-NH2 和-COOH 共同参与的化学反应与茚三酮反应：氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中加热可产生有色化合物,含游离-氨基的氨基酸和肽类生成蓝紫色化合物,脯氨酸(Pro)生成黄色化合物。较灵敏,颜色深浅可定量。成肽反应 4）R 侧链的活性基团发生的化学反应氨基酸以肽键共价连接形成线性序列多肽链，多肽链折叠形成蛋白质特殊的构

10、象（conformat）。蛋白质有四种结构层次：一级结构（primary structure ）；二级结构（secondary structure ）；三级结构（tertiary structure ）；四级结构（quaternary structure ）（不总是有）。三、蛋白质的一级结构：化学结构，即蛋白质分子中氨基酸的线性序列。1、肽：氨基酸通过肽键相连而形成的化合物。概念：肽键（酰胺键）：一个氨基酸的-羧基与另一氨基酸的-氨基脱水缩合形成的键。N-端：肽链有游离的氨基的一端 C-端：肽链有游离的羧基一端氨基酸残基(amino acid residues)：肽链中的每个氨基酸部分多肽链主

11、链（main chain of polypeptide chain ）：由肽键连接各氨基酸残基形成的长链骨架多肽链侧链(side chain)：蛋白质多肽链中的各氨基酸侧链基团寡肽(oligopeptide)（20 个以下氨基酸残基）多肽 (polypeptide )（多于 20个氨基酸残基）蛋白质:由一条或几条多肽链组成的生物大分子。肽的书写格式：游离-氨基在左，游离-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。化学名称：某氨酰 某氨酰 某氨酰某氨酰 某氨酸（3）重要的多肽生物活性肽（含量极少，很难纯化，具有重要的）谷胱甘肽 (gluhe,GSH)：谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸（三肽）多肽类激素：促甲

12、状腺素激素(焦谷氨酰 组氨酰 脯酰胺)；Met-脑啡肽（Tyr-Gly-Gly-e-Met）；Leu-脑啡肽（Tyr-Gly-Gly-e-Leu）；催产素（9 肽）；升压素（9 肽）；促肾上腺皮质激素（ACTH：39 肽）；胰高血糖素（胰岛-细胞29 肽）。多肽类抗生素等等。一级结构(primary structure)：就是蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。一级结构中包含共价键（covalent bonds）：肽键（peptide bond）和二硫键（disulfide bond）。一级结构是蛋白质的基本结构，决定着蛋白质的空间结构。一级结构测定步骤（1）纯化样品，N-端

13、或 C-端末端分析，测定由几条肽链组成。 N-末端氨基酸的分析：Sanger 法（2,4-二硝基氟苯与 N 端氨基进行烷化反应,生成二衍生物,酸水解得到黄色 DNP-氨基酸,可用乙醚抽提再进行色谱分析）；丹磺酰氯法（有很强荧光,灵敏度高）；Edman 法（苯异硫腈( TC)与 a 氨基反应生成 PTC-多肽,酸水解后得到 PTH-氨基酸,后者可用乙酸乙酯抽提后进行鉴定）；氨肽酶法（外肽酶：肽链外切酶）C-末端氨基酸的分析：羧肽酶法（羧肽酶A 水解脂肪或芳香族氨基酸的C-末端,羧肽酶B 水解碱性氨基酸的C-末端）；与苯沉淀等。（2）拆分二硫键：还原法（含巯基化合物（-SH）如 2巯基乙醇使-SS

14、-还原产生两个半胱氨酸残基（Cys-SH）,烷化剂（如碘乙酸）修饰-SH，生成）；氧化法（过甲酸使-SS-氧化断裂，生成半胱氨磺酸）。（3）氨基酸组成分析：水解样品，氨基酸自动分析仪测定。二硫键再酸水解法：6mol/L HCl110加热回流 1624h, 完全水解，Trp 被破坏，Gln,Asn酰胺基水解变成 Glu,Aslx,Asx)近年来用甲基磺酸代替盐酸。碱水解法：6mol/L NaOH 煮沸 6h,完全水解，消旋，Ser、Thr、Arg、Lys 和 Cys 破坏 。（4）多肽链的部分断裂和肽段分离：将蛋白质分解为若干个一定长度的小片段（ 至 少 两种 不 同 方法 水解 成 两 套肽

15、段 ） 。酶水解法：内肽酶（肽链内切酶）胰蛋白酶法：水解 Lys 或 Arg 的羧基形成的肽键糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）法：水解成的肽键e 、Trp 和 Tyr 等疏水氨基酸的羧基形胃蛋白酶法：被断裂键两侧的残基都是疏水性氨基酸如：-e-e-化学法CNBr 法：裂解由 Met 羧基形成的肽键。（5）测定每条小肽片段中的氨基酸排列顺序（通常用 Edman 降解法）推断蛋白质的氨基酸排列顺序（确定二硫键和酰胺基的位置。肽拼凑）四、蛋白质的空间结构（构象：conformat）：高级结构，蛋白质分子中所有原子在三的排列分布和肽链的。构象决定着蛋白质的分子形状、理化性质和生物学活性。1、蛋白质的二级结构(

16、secondary structure):多肽链本身的折叠和盘绕方式，是空间结构单元。（1）、肽键平面（酰胺平面：肽单元）：肽键-CO-NH-的碳与氮之间有部分双键性质，不能转动，2 个C在肽键的异侧（反式构型），与肽键相关的 6 个原子（肽键-CO-NH-中的 4 个原子和它相邻的两个-碳原子）形成一个刚性平面。N-Ca 键和Ca-C 键是单键，N-Ca 键（）和 Ca-C 键（）可（180180）旋转,二面角（，）决定了相邻肽平面的相对空间位置。一个蛋白质的构象取决于肽绕 N-Ca 键和Ca-N 键的旋转，旋转受到肽链的主链和相邻残基的侧链原子之间的干扰的限制。（2）、二级结构的型式1）、

17、-螺旋 (-helix)：肽平面通过碳原子旋转，使碳链主链沿中心轴盘曲成稳定的右手螺旋构象。许多蛋白和球蛋白存在。结构要点：一般为右手螺旋，57，47，每个螺旋圈含 3.6 个氨基酸残基，螺旋间距离（螺距）为 0.54nm，每个残基沿轴旋转 100，上升 0.15nm；螺旋圈之间通过氢键维持结构稳定，第N 个氨基酸残基的羰基氧与第N4 个氨基酸残基的氨基氢形成氢键，氢键的平行于螺旋轴；R 侧链基团伸向螺旋的外侧 ，其大小、形状及电荷等是影响此结构形成的主要。表示：ns 螺旋。例如：3.613 螺旋，310 螺旋和 4.416 螺旋（-螺旋）2）、-折叠片层(-pleated sheet)：肽链

18、按层排列，以肽键平面为折叠成锯齿状的一种较伸展片层结构。许多蛋白和球蛋白存在。结构要点：肽链较伸展，每个残基大约占 0.320.34nm，肽键的平面性使多肽折叠成片，遇C发生折叠,形成锯齿状结构，氨基酸R 侧链交错位于折叠片的上面和下面，两个残基形成一个重复平行排列，形成片层结构，相邻多肽链的；肽链按层排列，两条或多条肽链片段可以是顺向平行（平行）或反向平行（反平行）；相邻肽链上所有的羰基氧和氨基氢形成链间氢键维持结构的稳定性。平行(Parallel)：119，113；重复(Anti-parallel)：140，135；重复0.65nm。反平行0.70nm。、-转角(-turn):多肽链反转方

19、向 180。的回折形成发夹形状。球蛋白存在。结构要点：常位于三维结构的表面；一般由四个氨基酸组成，常见氨基酸： Pro,Gly,Asp,Asn,Trp；以氢键维持稳定，第 1 个氨基酸残基的 C=O 与第 4 个残基的 N-H 之间形成氢键。、不规则卷曲(random coil)：没有确定规律性的松散肽链结构。2、蛋白质的三级结构(tertiary structure)（1）、超二级结构（super-secondary structure）：三级结构的“建筑模块”1）、模体或模序（motif）：在空间上靠近的二级结构单元彼此相互作用，形成的有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。常见类型：、

20、等、结构域（）：球状蛋白质的折叠单位。在模体或模序的基础上进一步绕曲折叠形成的具有部分生物功能的紧密的近似球形的空间结构区域。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。（2）蛋白质的三级结构(tertiary structure)：多肽链上的所有原子（包括主链和侧链）在三的分布。结构特点：大多数可离子化的残基都位于分子表面，疏水氨基酸残基大部分埋藏在分子（特别是一些疏水性强的氨基酸），多肽链高度折叠成紧密球形或椭球形结构.稳定维系三级结构的作用力有：氢键、离子键、疏水键、二硫键和配位键。三级结构对于蛋白质的分子形状和生物学活性非常重要。肌红蛋（Myoglobin

21、），丙糖磷酸异构酶等。（3） 蛋白质的四级结构(quaternary structure)：两个以上多肽亚基（subunit）（非共价键连接）在蛋白质分子内的空间排布和相互关系。亚基或亚（subunit）：每一条具有独立三级结构的多肽链。血红蛋白（Hemoglobin）五、蛋白质分子中的共价键与次级键1、共价键：肽键，二硫键 2、次级键：氢键，疏水键，盐键，力维持蛋白质空间结构的化学键：氢键，疏水键，盐键，键。力，二硫键，配位六、蛋白质的折叠（protein folding）：伸展的肽链形成特定的三维结构，使无活性的分子成为具有特定生物学功能的蛋白质。参与体内多肽链折叠的蛋白质分子伴侣（mol

22、ecular chrone）：帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价的组装的蛋白质。酶：蛋白质二硫键异构酶，肽基脯氨酸顺-反异构酶等。七、胶原蛋白（collagen） 原胶原蛋白分子头尾相连，交错排列，分子间共价交连，形成特征性的带状束。原胶原蛋白：3 条左手螺旋多肽链相互缠绕形成右手超螺旋分子，长 300nm，直径为 1.5nm；靠链间氢键以及螺旋和超螺旋的反向盘绕维持超螺旋结构稳定性。胶原链：每一圈螺旋含 3 个氨基酸残基，每一个氨基酸残基轴向距离为 0.31nm，螺距为 0.94nm；三联体序列-Gly-Pro-Hyp-常重复出现。（二）蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与

23、构象和功能的关系1.一级结构不同,生物学功能各异：加压素和催产素 2.一级结构的关键部分相同.其功能也相同：同源蛋白 3.一级结构的关键部分变化,生物学活性改变或丧失 4、一级结构的变化与疾病的关系：镰刀状红细胞性贫血(Sickle cell anemia) (二)、蛋白质构象与功能的关系1、酶原的激活空间构象的改变2、蛋白质的变构现象别构效应(allosterism)别（变）构作用：含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质和功能发生改变的作用。别构效应(allosterism)：因别构而产生的效应称别构效应。别构蛋白：具有别构效应的蛋白质。血红蛋白正协同效应（i

24、tive cooperativity）：第一个氧分子与一个亚基结合，使余下的 3 个亚基的血红素更容易与其它的氧分子结合。结合每一氧分子都会使血红蛋白对氧的亲和性增加，这种互相作用的结合现象称之结合的正协同性。效应（Bohr effect）：CO2 浓度的增加降低细胞内的，血红蛋白结合H和 CO2 使得血红蛋白对氧亲和力下降，血红蛋白的 P50 升高。（三）蛋白质的理化性质及其分离纯化一、蛋白质的理化性质1、蛋白质两性解离特性：蛋白质具有可解离 H+的酸性基团和结合H+的碱性基团，具有两性解离特性，在溶液中起酸碱缓冲作用。（1）等电点（质的等电点。）: 使某一蛋白质所带正负电荷相等时的溶液值称

25、为该蛋白I,蛋白质带正电；I,蛋白质带负电,体内蛋白质的大多为 5 左右,故生理条件下一般以负离子形式存在；等电点时为两性离子。（2）各蛋白质的一级结构不同，不同，荷电种类和数量也不同。（3）应用：等电点沉淀、离子交换层析和电泳。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。离子交换层析（Exchange Chromatogray 简称为 IEC）：是依据相中的组分离子与离子交换剂（固定相）上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。阴离子交换层析基本分离过程：阴离子交换剂装柱平衡（RX+Y-）加样（待分离溶液：可能有正电基团、负电基团和中性基团）：负电基团（A-）与平衡离子（Y

26、-）进行可逆置换，结合到离子交换剂上（RX+A-）。正电基团和中性基团不能与离子交换剂结合，随相流出而被去除。洗脱；洗脱液中的离子与结合在离子交换剂上的各种负电基团（A-）进行置换，各种负电基团（A-）按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，随洗脱液流出。2、蛋白质的亲水特性（1）、球状的水溶性蛋白亲水基团分布于分子表面，疏水基团由疏水作用聚合在分子。（2）、分子表面的亲水基团与周围水分子结合形成水化层(水膜)。H+,带一定电荷，水溶液中蛋白质颗粒（3）、分子表面的亲水基团可结合或带相荷。3、蛋白质的胶体性质：蛋白质水溶液是稳定的胶体溶液，具有胶体溶液的特点。蛋白质胶体溶液稳定的原

27、因：1）胶体颗粒直径；2）表面形成水膜（水化层）；3）带相荷。4、蛋白质的沉淀反应：破坏胶体溶液稳定的。（1）、中性盐沉淀反应：高盐破坏水膜、中和电荷,蛋白质白质不变性。沉淀盐析，蛋盐溶作用：稀盐使蛋白质表面同性电荷增加，增加蛋白质分子间的排斥,同时与水分子间的作用增强,而增加溶解性。分级（段）盐析：不同蛋白质盐析的盐浓度不同,用不同盐浓度分级沉淀蛋白质。（2）、沉淀反应：用与水互溶的乙醇、等夺取水膜,等电点时加入更易沉淀,易引起变性（与浓度、作用时间和沉淀温度有关）。（3）、重金属盐沉淀反应：蛋白质在体内一般为负离子,可与 Cu2+，Hg2+，Ag+和 Pb2+等结合为不溶性蛋白盐而沉淀。（

28、4）、生物碱试剂的沉淀反应：蛋白质在I 时带正电荷,可与、磷钨酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水杨酸等结合沉淀。（5）、加热沉淀反应 ：蛋白质热变性沉淀，等电点时最易沉淀。凝固：变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象。5、蛋白质的变性与复性（1）、蛋白质变性:概念：在理化作用下,蛋白质分子内的二硫键和非共价键被破坏,分子原有的高度规律性的空间排列发生变化，天然构象发生变化,引起蛋白质理化性质和活性的改变（原有性质发生部分或全部丧失）。变性本质:空间构象的改变或破坏。变性特征:生物活性丧失（主要标志）。理化性质改变：分子形状改变，肽链松散伸展，反应基团增加，易被水解,易被酶消化。蛋白质变性后亲水基团被掩埋,

29、溶解度降低、失去水膜，易形成沉淀析出;但若溶液与蛋白质的差别较大,蛋白质仍不易沉淀。球状蛋白质的不对称性增加、粘度增加、扩散系数降低,某些蛋白质结晶能力丧失。（2）、蛋白质复性：有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。6、蛋白质的其它特性、紫外吸收特性：Trp、Tyr、e 等氨基酸残基可特异地吸收紫外光:max=280nm、颜色反应双缩脲反应：肽键与碱性铜溶液产生兰色络合物，肽键越多颜色越深。用于蛋白质定性定量和检测蛋白质水解程度。酚试剂反应：碱性条件下,Tyr 和 Trp 可与含磷钨酸-磷钼酸的酚试剂化合物生成兰色物,兰色强度与蛋白质量成正比

30、,测定蛋白质常用方法。反应、黄色反应、乙醛酸反应(Ho反应)、茚三酮反应等。二、蛋白质的分离纯化ing-Cole 反应、坂口反应(Sakaguchi蛋白质研究基本步骤：一般温和物理方法（盐析、透析、电泳、层析和超速离心等）提取和纯化蛋白质；测定氨基酸组成，分析氨基酸顺序；确定空间结构（X射线衍射法、NMR 或生物学1、生物大分子的推测）并进行生物学活性的鉴定。（1）、生物大分子的特点(与化学产品的分离比较)1）许多生物大分子含量微，耗用生物材料多；2）分离纯化的步骤多，流程长；3）分离纯化方法差别大，没有标准方法；4）生物大分子极易失活，分离纯化时要选用最适宜的环境和条件防止失活；5）中各种参

31、数的综合影响，很难准确估计和判断，实验的重复性较差；6）研精神。过程复杂，更需百折不挠的钻（2）、生物大分子的基本步骤1）确定目的和要求；2）掌握目的产物的物理化学性质；3）建立相应的可靠的分析测定方法；4）生物材料的破碎和预处理；5）选择和探索分离纯化方案；6）纯度鉴定；7）产物的浓缩，干燥和保存。2、蛋白质的（1）、前处理：1）选择适当的生物材料（适合的目的和要求；尽可能保持新鲜）。加工处理：动物组织除结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎；植物去壳、除脂；微生物材料及时将菌体与发酵液分开破碎细胞机械法：研磨；组织捣碎器物理法：反复冻融法；超声波；压榨法；冷热交替法化学与生物化学方法：自溶法；溶

32、胀法；酶解法；处理法。4）提取蛋白质：目的蛋白保持天然状态充分到溶剂中。水溶液：稀盐溶液和缓冲液。通常 05使用 0.02mol/L0.05mol/L 缓冲液或 0.09mol/L0.15mol/LNaCl 溶液=68(偏离等电点的两侧)提取蛋白质和酶。加入抑制剂或调节提取液的、离子强度或极性使蛋白酶或核酸酶失活；加入少量巯基乙醇或半胱氨酸防止巯基氧化。：乙醇、异丙醇、正丁醇等（2）、分离纯化：依据目的蛋白与杂质之间的物理化学和生物学性质上的差异，选择正确的分离纯化方法（分离纯化方案）分离纯化方法以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。以溶解度的差异为依

33、据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等早期和晚期的分离纯化方法早期分离纯化（粗分级）：除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质。方法：吸附；萃取；沉淀法（热变性、盐析、沉淀等）；离子交换；亲和层析等快速、粗放；能较大地缩小体积；分辨力不太高；负荷能力大。晚期分离纯化（细分级）：除去与目的产物物理化学性质差异小的杂质。方法：吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦电泳、HPLC 等。3）蛋白质含量测定与纯度鉴定：含量测定：凯氏定氮法、双缩脲法、

34、Folin-酚试剂owry 法，标准测定方法）、紫外吸收法、（考马斯亮蓝）、胶体金法。均一性的鉴定：电泳、离心沉降、HPLC 和溶解度分析等（同时采用 23 种不同的纯度鉴定法确定）。（3）、样品浓缩、干燥和保存：浓缩：减压加温蒸发浓缩；空气透析法等。蒸发浓缩；冷冻干燥法；吸收法；超滤法；干燥：冷冻或真空干燥，然后分装并写明。保存：2070保存（液态样品不能太稀，一般需加入防腐剂和稳定剂。）小结习题酶化学重点：酶的结构与功能关系；酶的动力学基础。（一）、酶通论每一种生命过程必需生物催化剂（Biocatalysts）一、酶的研究历史：1、酶的发现和提出；2、提出酶促动力学原理4、RNA 具有催化

35、作用二、酶的概念及作用特点学说；3、确立蛋白质本质；1、概念：生物活细胞产生的、具有催化能力的以蛋白质为主要成分的生物催化剂（Biocatalysts）。酶促反应（Enzymatic react）：酶催化的生物化学反应。底物（substrate）：由酶催化，发生化学变化的物质。2、酶的作用特点、与一般催化剂的共性、生物催化剂的特性1）高效性：显著降低化学反应的活化能，提高反应速度 10101倍（非酶催化剂）或 1081020 倍（非催化反应）。2）专一性：又称特异性，是指酶对底物严格的选择性。酶只作用于某一种或某一类特定的底物。结构专一性：绝对专一性（Absolute specificity）

36、：只作用于一个特定的底物。例如：脲酶、麦芽糖酶、淀粉酶等相对专一性(Relative Specificity)：作用于一类化合物或一类化学键族(group)专一性：对键两端的基团要求的程度不同，只对其中一个基团要求严格。键(Bond)专一性：对于键两端的基团没有严格的要求。化学（异构）专一性：旋光异构专一性：选择性催化旋光异构体的一种。几何异构专一性（geometrical specificity）：选择性催化几何异构体的一种构型潜(前)手性专一性3）反应条件温和：常温、常压和接近中性酸碱度水溶液中进行4）酶易失活：使蛋白质变性的性。（如强酸、强碱高温等）能使酶变性失去活5）酶可调节控制：酶和

37、代谢物的区域化分布；变构调节、共价修饰调节和酶原激活；酶含量的调节（诱导、阻遏和降解）；激素调节等。6）某些酶催化与辅酶、辅基及金属离子有关7）酶促反应无副反应三、酶的化学本质1、大多数酶是蛋白质：酶水解的产物是氨基酸；使蛋白质变性的也能使酶变性；酶具有两性解离和等电点性质；不能透过半透膜；和蛋白质具有相同的颜色反应2、Ribozyme（核酶）：有催化活性的天然 RNA四、酶的化学组成1、单纯酶(simple enzyme)：氨基酸2 、结合酶（Conjugated enzyme）：全酶（holoenzyme）酶蛋白（apoenzyme）：脱辅酶（apoprotein），氨基酸，决定酶的专一性

38、辅因子（cofactor）：金属离子或有机小分子化合物，作为电子、原子或某些化学基团的载体，决定酶的催化性。辅基(prosthetic group):与酶蛋白以共价紧密结合,不容易被透析或超滤法除去，如和生物素等。辅酶(coenzyme):与酶蛋白以非共价键疏松结合,容易被透析或超滤法除去，如TPP、NAD 等。五、酶的结构组成1、单体酶（monomeric enzyme）：一条肽链或几条肽链共价缔合，最高结构为三级结构。2、寡聚酶 (oligomeric enzyme)：两个或两个以上亚非共价键结合，最高结构为四级结构。3、多酶复合物(multienzyme system)：几个功能相关，不

39、同种类的酶以非共价键彼此聚合而成的复合物游离可溶型、可溶型多酶复合体和膜结合多酶复合体4、多功能酶（multifunct六、酶名al enzyme）或串联酶（tandem enzyme）1、命名法:根据催化底物命名（蛋白酶；淀粉酶）根据催化反应的性质命名（水解酶；转氨酶；裂解酶等）结合上述两个原则命名（琥珀酸脱氢酶）在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点缺点：一酶多名，一名多酶，写出反应难。2、国际系统命名法：底物名称（构型）+反应性质+酶。底物全部列出，用冒号（:）分隔。水解反应的底物水和反应类型可省去。七、酶的分类国际系统分类法：1961 年国际酶学机理，分成 6 大类：（Enzyme C

40、ommittee, EC）根据酶所催化的反应类型和1、氧化-还原酶类（Oxido-redu或电子传递的反应。es）：催化氧化-还原反应，主要是氢的转移脱氢酶类(dehydrogenase)：催化直接从底物上脱氢的反应。氧化酶类(Oxidase)过氧化物酶加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）2、转移(移换)酶类（Transferases）：催化化合物中某些基团的转移。根据基团分成 8 个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。3、水解酶类（hydrolases）：催化底物的加水分解反应。4、裂合（裂解）酶类（Lyase）：催化从底物分子中非水解性移去一个基团或原子形成双

41、键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶（脱水酶）及脱氨酶等。 5、异构酶类（Isomerases）：催化各种同分异构体的相互转化。常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。6、酶类（Ligases or Synthetases）：连接酶，与 ATP 分解反应相偶联催化 C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。酶的（号码）：EC 酶大类号.亚类号.类号.序号Ribozyme（核酶）：具有催化功能的 RNA 分子种类：自催化核酶催化分子内反应；分子间催化核酶Abzyme（抗体酶）：具有酶活性的抗体（二）、酶的结构一、酶分子结构：一般球状蛋白，具有一、二、三、四级结构。二、酶的

42、活性中心（active center）1、概念：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。2、酶活性部位的主要特征占据的空间很小；位于酶分子的特定空间结构区域：酶蛋白的两个结构域或亚基之间的裂隙（clefts 或 crevi），或分子表面的凹槽；（3）三结构，一条或几条多肽链上空间位置比较靠近的氨基酸残基或其基团组成,包括:COOH、NH2、OH、SH 和咪唑基等,辅助因子参与活性中心；含有结合底物部位和参与催化底物转化为产物的催化部位；结合底物的特异性取决于活性部位中精确的原子排列；底物大都是通过相对弱的力与酶结合。3、酶活性的必需基团（essential group）概念：多肽

43、链上间接或直接与酶催化活性相关的某些功能基团。类型：活性中心必需基团结合基团(binding group)：专一性催化基团(catalytic group)：催化性质活性中心外必需基团:稳定酶分子的构象（三）、酶促反应的机制一、酶促反应的能力学基础：酶降低化学反应活化能，使活化分子数增多。酶促化学反应能方程式：G=H-TS二、中间产物学说：酶底物复合物酶与底物结合特点：（1）酶活性中心与底物结合；（2）可逆的、非共价的结合；（3）诱导契合（induced fit）模式。酶与底物的过渡态互补，亲合力最强，出结合能，使 ES 的过渡态能级降低，有利于底物分子能垒，加速酶促反应速度。三、诱导契合假说

44、（induced-fit hypothesis）：1958，Koshland，酶活性中心的结构是柔性的，当底物与酶分子结合时，底物分子诱导酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化，使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向，转入有效的作用位置，使酶与底物完全吻合，契合形成中间产物酶底物复合物。锁钥学说：酶和底物的关系就象锁与那样的刚性关系，酶活性中心结构与底物的结构互相吻合，紧密结四、使酶具有高催化效率的 1、邻近定向效应：中间络合物。酶与底物结中间产物过程中，底物分子从稀溶液中密集到活性中心区，并使活性中心的催化基团与底物的反应基团之间正确定向排列所产生的效应。2、“张力”与“形变”：酶

45、与底物结合，底物分子也会发生变形，使底物分子的某些键的键能减弱，产生键，降低了反应活化能。3、酸-碱催化：通过暂时提供或接受一个质子稳定过渡态。功能基团有氨基、羧基、咪唑基、巯基和酚基等。4、共价催化：酶分子上的活性基团与底物以共价键结合，形成过渡态。亲核催化：带有多电子的原子如 O、S 和N 提供电子底物上相对带正电子的原子（如羰基碳）。亲电催化：亲电试剂(具有接受电子对的原子)引起的催化反应,是亲核催化的反过程。5、表面效应(surface effect)：疏水性“口袋”效应酶活动中心微环境是疏水性的，有利于多种催化方式的进行。多元催化(multielement catalysis)：多个

46、基元催化形式协同作用。（四）、酶促反应的动力学酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其影响。酶促反应速度：时间内底物减少或产物增加的速度，常用初速度来衡量。影响酶促反应速度的：一、底物浓度对酶促反应速度的影响1、底物浓度与反应速度关系曲线：矩形双曲线一级反应：当S很低时，S与v成比例混合级反应：当S较高时，S与 v不成比例零级反应：当S很高时，S，v 不变，达到最大反应速度2、中间产物学说解释：底物浓度很低时，有酶与底物结合，随着底物浓度的增加，中间络合物的浓度不断增高。底物浓度较高时，酶饱和，增加底物浓度无随底物浓度的增加而增加,达到最大反应速度。3、米曼氏方程（Michaelis-Menten

47、 equat的中间产物生成，反应速度不再）：V=Vmax.S/(Km+S)(1)、成立条件：初速度为标准；单底物；稳态（steady se）(2)、推导方程:稳态时，ES 生成速度=ES 分解速度，k1（E-ES）S=k2ES+k3ES (3)、米-曼氏方程解释：当SKm 时，vVmax,即S而 v 不变(4)、Km 与 Vmax 的意义1) Km 的意义最大反应速度一半时的底物浓度酶的特征性常数之一,Km 值范围在 10-6-10-2mol/Lk2k3，Km 可表示酶对底物的亲和力大小，Km 与酶对底物亲和力大小成反比推测正确测定酶时所需的底物浓度推断某一代谢物在体内可能的代谢途径，决定于

48、km 最小的酶。2)Vmax 的意义：酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度呈正比：Vm=K3ES=K3E (5)、Km 值与 Vmax 值测定 v 与S的关系曲线双倒数作图法又称林- 1/V=Km/Vmax.1/S+1/Vmax(Lineweaver-Burk)作图法斜率=Km/Vmax；纵轴截距 1/Vmax；横轴截距-1/Km。二、酶浓度对反应速度的影响：反应速度与酶浓度成正比v=k3ES/Km+S当SE,式中 Km 忽略不计。v=k3E三、温度对酶促反应速度的影响两种不同影响：温度升高，反应速度加快；温度升高，热变性速度加快。酶活性与反应温度的关系曲线:一般最适温度:酶活性最高时的温度

49、,也即酶促反应速度最大时的温度。四、对酶促反应速度的影响对酶作用的影响：1、影响酶活性基团、底物的解离；2、过酸、过碱使酶变性失活。酶活性与的关系曲线:一般最适：酶活性最高时的,也即酶促反应速度最大时的。最适温度、最适不是酶的特征常数，会受到酶的浓度、底物以及缓冲液的种类等的影响。五、抑制剂对酶促反应速度的影响抑制剂：改变酶的必需基团或活性部位基团的化学性质，间接或直接地影响酶的活性中心,使酶活性降低甚至失活但不引起酶蛋白变性的物质。抑制作用:使酶活性降低或丧失。抑制程度:由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。1、不可逆抑制（irreversible inhibit）与

50、酶的必需基团共价结合,使酶丧失活性,不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢性。2、可逆抑制(reversible inhibit)与酶以非共价键疏松结合使酶活性降低或丧失,能够通过透析、超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢性。（1）竞争性抑制(competitive inhibit特点：I 与S 分子结构相似；)抑制剂和底物竞争酶的活性中心结合部位Vmax 不变，表观 Km 增大；抑制程度取决于 I 与 E 的亲和力，以及I和S的相对浓度比例。增加S浓度可以解除抑制。（2）非竞争性抑制（特点：I 与S 分子结构不同；Vmax 减小，表观 Km 不变；抑制程度取决于I大小。petitive inhi

51、bit）（3）反竞争性抑制（特点：petitive inhibit）I 与S 分子结构不同,I 只与ES 结合Vmax 和表观 Km 都减小；抑制程度取决于I和ES二者的浓度。六、激活剂对酶促反应速度的影响激活剂:使酶活性由无变有或增加的物质。必需激活剂：使酶活性由无变有。例如:Mg2+对己糖激酶非必需激活剂：使酶活性显著增加。例如:Cl-对淀粉酶激活作用：使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加。（五）、酶的调节一、酶活性的调节：共价调节：1、酶原激活酶原（zymogen）：在细胞内或初时无活性的酶的前体。（1）概念:在特定条件下，酶原被水解一个或几个特定肽段致使酶分子构象发生重塑，酶活性的过程

52、。实质：酶活性部位形成和的过程。例：胰蛋白酶原的激活过程；肠激酶启动的酶原激活（2）酶原与酶原激活的生理意义1）保护此酶组织免受酶的水解破坏；2）保证酶在特定时空发挥催化作用；4）酶原可作为酶的形式。2、酶的可逆共价修饰（covalent modificat）概念：在其他酶的催化下，酶分子上特定基团与某种化学基团发生可逆性共价结合，从而改变酶的活性。可逆共价修饰酶：能可逆共价修饰的酶。共价修饰基团类型：磷酸化/去磷酸化、乙酰化/去乙酰化、甲基化/去甲基化、腺苷化/去腺苷化等。例：肌肉中磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化过程：酶促化学修饰对酶活性的调节例：糖原磷酸化酶：磷酸化激活（磷酸化酶a）/脱磷酸化

53、抑制（磷酸化酶b）；糖原酶：磷酸化抑制/脱磷酸化激活（4）激素启动的磷酸化级联机制：激素+受体腺苷酸环化酶活化c别构激活蛋白激酶A有活性磷酸化酶激酶（磷酸化）有活性磷酸化酶a（磷酸化酶b 磷酸化）非共价调节：3、酶的变构调节（allosteric regulat）别构酶（allosteric enzyme）：具有类似血红蛋白那样的别构效应的酶。特点：一般是寡聚酶；具有别构效应；v 对S不呈直角双曲线，是 S 形曲线。变构调节：酶的别构部位与变构剂结合，引起酶活性部位的构象改变从而改变酶的活性。别构抑制：负变构剂与酶的别构部位结合而引起酶活性下降。反馈抑制：代谢过程中局部反应产物对催化该反应的酶

54、起抑制作用。反馈抑制可认为是可逆抑制。别构激活：正变构剂与酶的别构部位结合而引起酶活性增加。例如：c激活蛋白激酶A限速酶：控制着整个代谢通路进行速度的酶在续的反应链中反应速度最慢的那一步反应的酶,可通过化学修饰和别构效应调节此酶活性。二、酶含量的调节1、酶蛋白的诱导和阻遏转录水平(1)诱导作用（induct (2)阻遏作用（repres 2、酶蛋白降解的调控）和诱导剂（inducer）和辅阻遏剂（corepressor）无选择性蛋白降解：溶酶体选择性蛋白降解：ATP+泛肽+泛肽结合降解酶三、同工酶（ioenzyme）1、概念：催化相同化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存

55、在明显差异的一组酶。2、本质：同一种属中由不同体或杂合体。或等位编码的多肽链所组成的单体、纯聚3、存在：同一的不同或相同组织的同一细胞中,对代谢调节有重要意义。例如：乳酸脱氢酶（LDH）同工酶（六）、酶的与测定一、酶测定酶活性：酶催化某一化学反应的能力，以酶促反应速度来衡量。酶活性：指酶促反应在时间（s,min,h）内生成一定量（mg, g, mol）的产物或消耗一定量的底物所需的酶量。一个国际（IU,1976 年）：在特定条件下(最适的反应条件:25),1min 内催化 1mmol 底物转化为产物所需的酶量定为一个酶，1IU=1mol/min一个催量（kat）：在特定条件(最适条件)下,1S

56、ec 内使 1mol 底物转化为产物所需的酶量。即 1kat=1mol/s；1IU=16.6710-9kat=16.6710 -3mKat；1Kat=6107IU转换数（turnover number）：每秒钟每个酶分子能催化的发生变化的底物微摩尔数，用kcat 表示（mmol/S）。酶比活：每毫克蛋白所含有的酶数。纯化倍数=每次比/第一次比产率%（回收率）=（每次总/第一次总）100三、酶的工业上大多采用微生物发酵的方法来获得大量酶制剂。酶分离纯化的三个基本步骤：1、抽提；2、纯化；3、结晶或制剂。小结习题维生素化学重点：B 族维生素与辅酶（基）一、概述1、维生素（Vitamin）的定义：维

57、持正常生命活动所必需的一类小分子有机化合物。2、维生素的特点：（1）既不供给能量，也不组织成分；参与体内物质代谢与调节。（2）体内不能或甚微，必须由食物供给。（3）需要量很少，但不可缺少（mgmg/d)；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病维生素缺乏症。3、维生素名按发现先后：A、B、C、D、根据化学结构或生理功能命名：硫胺素初发现时以为是一种，以后证实是几种维生素的混合物，则在字母右下方注以 1、2、34、维生素的分类（1）脂溶性维生素：维生素A、D、E、K 等（2）水溶性维生素：维生素B 族（B1、B2、泛酸、维生素 PP、B6、生物素、叶酸，B12）和维生素 C 等。二、脂溶性维生素

58、1、维生素 A：视黄醇（1）化学结构及性质1）结构：-白芷酮环的不饱和一元醇，包括A1 和A2 两种。维生素A 原：本身不具有 VitA 活性，但在体内可转变为 VitA 的物质，如类卜素。2)性质：活泼、空气中易氧化，紫外线照射可破坏，食物中稳定。（2）生物化学功能及缺乏病1）功能：视觉细胞内感光物质：视紫红质=视蛋白+11-顺视黄醛维持上皮组织结构的完整和健全，促进上皮细胞糖蛋白的促进生长发育；防癌作用。2）VitA 缺乏：夜盲症，粘膜干燥，干眼病2、维生素 D：抗佝偻病维生素。（1）化学结构及性质；1)结构：类固醇衍生物，维生素 D2、D3、D4、D5 四种，其中D2 和D3 较为重要。

59、维生素D3 原：7-脱氢胆固醇D3（胆钙化醇）活性形式：1,25-(OH)2-D32)性质：稳定、耐热（2）生物化学功能及缺乏病功能：调节钙、磷代谢，促进 Ca、P 吸收，维持血液正常的钙、磷浓度，促进钙化，使牙齿、骨骼发育正常。VitD 缺乏：小儿(佝偻病),成人(软骨病或骨质疏松)3、维生素 E：酚或抗不育维生素（1）化学结构及性质1)结构：苯骈二氢吡喃衍生物，已知有 8 种，其中 4 种（、-酚）较为重要，-酚的效价最高。2)性质：对热稳定，对氧敏感：抗氧化剂（2）生物化学功能及缺乏病功能：与生殖功能有关保护生物膜抗衰老、防癌及增强免疫作用VitE 缺乏：生殖系统的上皮细胞毁坏，雄性，不

60、，雌性流产或被溶化吸收。4、维生素 K：凝血维生素（1）化学结构及性质1)结构：2-甲基-1,4 萘醌衍生物，有K1、K2、K3 三种，K1、K2 为天然产物，K3为人工品。2)性质：耐热、易受光线和碱破坏。（2）生物化学功能及缺乏病功能：促进血液凝固（主要作用）VitK 缺乏：凝血时间延长，皮下、肌肉、胃肠。三.水溶性维生素1、维生素 B1：硫胺素（Thiamine）（1）化学结构及性质结构：由一含 S 的噻唑环和一含 NH2 的嘧啶环组成。性质：白色、有特殊香气，微苦，溶于水，耐热，加碱破坏。（2）生物化学功能及缺乏病1）功能：在肝中与焦磷酸（PP）结合形成 Thiamine pyroos