PCR测定的技术要点课件

1、1PCR测定的技术要点白雪丽山东省立医院检验科2PCR测定的技术要点PCR的定义PCR的基本原理PCR反应的基本成分及其对结果的影响PCR反应的基本条件及其对结果的影响PCR扩增产物的分析技术PCR技术的应用及其优缺点PCR假阳性与假阴性的预防对策3PCR的定义PCR （ polymerase chain reaction)即聚合酶链反应，是一种模拟天然DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA或RNA片段的技术。它能把极微量的遗传物质迅速而简便的扩增百万倍，使原来无法分析和检测的各种项目得以完成，它的问世，为传统基因分析和诊断技术带来了变革。5PCR的基本原理6PCR的基本原理 利用 DNA分子

2、能够变性与复性的特性，以待扩增的两条DNA链为模板，由一对引物介导，以4种dNTP为底物，经DNA多聚酶催化，在体外快速扩增特异性DNA序列 。 7PCR原理示意图9095变性4060退火 7075 延伸第一循环第二循环模板变性、退火延伸第三循环变性、退火、延伸总扩增产物：2n倍增加长片段序列：2n倍增加目的DNA： 2n -2n 倍增加目的DNA533553538PCR反应的基本成分及其对结果的影响缓冲液引物脱氧核糖核苷三磷酸（dATP dTTP dGTP dCTP)模板DNATaqDNA聚合酶Mg2+PCR反应体系： 30100l10引物引物大小上下游引物均为人工合成20nt左右的寡核苷酸

3、单链引物浓度一般在0.11mol/l浓度过高，非特异性增加浓度过低，敏感性下降引物特异性引物特异性决定扩增的特异性，不应与非扩增区域有同源性12模板种类 DNA或RNA浓度 102 copies/ml 纯度 标本需要纯化14TaqDNA聚合酶一般30100l 反应体系中需加入12U 浓度过高，非特异性增加 浓度过低，产物量降低15Mg2+一般为1.5mmol/l,为Taq酶活性所必需的浓度过高，非特异性增加浓度过低，产物量降低16PCR反应条件及对结果的影响17PCR反应条件及对结果的影响变性温度与时间复性温度与时间延伸温度与时间循环数18复性温度与时间复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复

4、性越好，但容易出现错配，增加非特异性结合。温度太高不利于复性，大多数PCR反应的复性温度在55 左右，时间30S。20延伸温度与时间引物延伸温度一般为72 。因为在这个温度下Taq酶有较高的活性，并且引物和模板的结合较为稳定。一般72 延伸1min对于 1kb以内的扩增片段就已足够，如果扩增片段1kb，延伸时间可相应延长。21PCRPCR扩增曲线23PCR扩增产物的分析技术24凝胶电泳分析技术主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。其中琼脂糖凝胶电泳因操作简单，较常用，一般采用浓度为 12%的琼脂糖凝胶。通过电泳分析技术可直接观察到有无扩增产物，及产物片段的大小。可用于扩增产物的定性分析。

5、26HCMV PCR产物电泳分析结果 594bp600bp2652bp800bp50bp350bpM 1 2 327探针杂交技术探针（probe)是通过一定手段标记的已知核酸序列。探针杂交技术的原理：在一定条件下扩增产物与其特异性同源探针可按碱基互补原则形成杂交链，通过对其中探针信号的检测来获得产物的信息。28膜上杂交技术通常采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。基本操作是将待测核酸片段通过凝胶电泳分离后转印到膜上或直接点样于膜上再与探针进行杂交，然后经过漂洗、显色得到检测结果。（Southern 印迹、Northern印迹、斑点杂交）可对产物进行定性分析，但对操作要求较高，一般只适用于科研工作。30膜上

6、杂交技术检测结果31微孔板杂交技术类似于ELISA技术中的双抗体夹心法。首先通过微孔板孔壁上包被的捕获探针来捕获PCR产物。然后再用带有标记的检测探针与产物另一区域杂交，经过漂洗显色即可判断结果。可用酶标仪判读，用于半定量测定。但整个操作过程不是全封闭的，易造成扩增产物污染。32微孔板杂交技术原理示意图杂交杂交洗板显色杂交洗板显色33荧光探针杂交技术是近几年发展起来的一项新技术，我们通常所说的实时荧光定量PCR技术多采用的该项技术，该技术反应体系中除常规引物外，还引入了荧光基团标记的特异性探针，探针可与模板一对一结合。包括：Taqman技术Lightcycler技术Molecular beac

7、on 技术34Taqman技术原理reporterquencher35荧光探针杂交技术优点：在全封闭条件下进行PCR定量，有效防止了扩增产物的污染。实时监测，荧光定量，结果直观，定量准确。结合了PCR技术与探针杂交技术的优点，特异性强，灵敏度高。36PCR技术的应用37PCR的应用科研：基因重组、蛋白表达DNA测序基因突变和重组的研究分子进化和种系发育的研究临床：感染性疾病的病原体检测遗传性疾病的诊断器官移植中的基因配型癌基因的检测38PCR在病原体检测中的优缺点39优点:灵敏度高102 copies/ml即可，斑点杂交敏感性为105 copies/ml 特异性强主要由引物特异性决定，对于一个

8、20nt的引物其非特异性配对的概率为1/4 20。PCR可以克服血清学诊断中存在的交叉反应可早诊断可在免疫学诊断窗口期就早期诊断不受患者免疫状态的影响PCR可对病原体进行定量分析并可对病原体进行基因分型，指导临床用药和治疗。40不足之处：操作复杂，技术不易被熟练掌握价格昂贵存在假阳性和假阴性结果41PCR假阳性和假阴性产生的原因和预防对策42假阳性产生的原因假阳性多为污染所致，包括：产物的污染样品的交叉污染重组质粒或培养物及其它的污染43假阳性的防范措施PCR实验室要有严格的分区（试剂准备区、标本准备区、扩增区、产物检测区）要建立规范化的操作程序，并严格按程序操作。吸取标本时使用带滤塞的吸头试

9、验前后用紫外线灯照射工作台面和室内设施注意实验室的定期通风使用防“污染”的PCR试剂(含UNG）44尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法： 可防止以前扩增产物对下一次PCR反映的影响。是一个连续的防污染过程。每次实验都必须使用。一般对103104拷贝/ml的产物污染有效。在反应体系中用dUTP代替dTTP，使产物中含大量dU，在下一次PCR反应中反应体系中加入UNG可去除dU，加热后产物链断裂，不能作为PCR反应的模板，而UNG在PCR循环高温变性一步就会失活，所以，对含dU的新合成PCR产物没有影响 。45 T A T A T A T A T A PCR A U A U A U UNG A A

10、A 加热 A A A PCR46出现污染后的对策积极寻找污染源彻底清洁工作环境、器械和仪器紫外照射工作台面及工作区彻底通风47假阴性产生的原因操作不当试剂质量差或过期仪器设备不准确其他48标本的采集和处理49标本的采集标本采集的时间标本采集部位的准备标本的类型和采集量采集标本的质量采集及运输容器标本采集中的防污染50标本采集的时间在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都会出现假阴性结果。51标本采集部位的准备采集部位的清洁消毒可去除微生物和其它杂物，但应适度，过度消毒可能会破坏靶微生物。52标本的类型和采集量标本采集类型要根据所检测的病原体而定，不同病原体存在部位不同，采集标本种类也就不同。53

11、采集标本的质量标本采集后，要对标本采集质量作出评价血液标本应观察有无溶血、脂血对于痰液、体液及分泌物标本，可先取少许标本离心，取沉淀镜下观察有无细胞及所需类型细胞数量54采集及运输容器标本采集要采用一次性材料，运输要求为密闭一次性装置。如需使用抗凝剂，一般采用EDTA或枸橼酸盐，因肝素对PCR反应有很强的抑制作用，且在核酸提取过程中难以去除55标本采集中的防污染采集过程中操作者应注意防范，避免在标本中混入操作者的毛发、表皮细胞、痰液56标本的处理57标本的处理全血标本EDTA-Na2或枸橼酸钠抗凝，不可使用肝素提取DNA检测，可4 短期保存检测RNA，应在取血后立即提取RNA，或保存于RNA提

12、取液中。58标本的处理血清室温待血自然凝固，离心分离血清，可在4 短期保存（36hr内使用），提取DNA提取RNA则应在1小时内分离血清，立即提取RNA59标本的处理外周血单个核细胞EDTA-Na2或枸橼酸钠抗凝，用淋巴细胞分离液，离心分离EDTA-Na2或枸橼酸钠抗凝，裂解全血中的红细胞洗涤后可存于-70 以下60标本的处理痰测定结核菌DNA，液化痰液，不能加热液化剂：二硫苏糖醇，或0.5%N-乙酸-L半光氨+1.45%枸橼酸钠+2%NaOH非结核菌，痰与生理盐水震荡混匀，自然沉淀后，取上清离心，沉淀物用于DNA提取痰中有血：必须加红细胞裂解液61标本的处理拭子拭子于适量生理盐水中充分震荡洗涤，室温静置510分钟后，取上清离心，沉淀用于DNA提取62标本的处理脓液水样脓液可直接离心，取沉淀提取DNA粘稠脓液的处理如同痰液处理63标本的处理体液胸水、腹水、脑脊液、羊水、尿液等直接离心，取沉淀作DNA提取血性者应先行红细胞裂解预处理后的标本可4 短期存放，也可保存于-70 以下64标本的处理新鲜组织生理盐水洗涤后，切碎，加入适量生理盐水制成组织匀浆，离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后，用酚-氯仿法提取DNA 50%乙醇中，1cm小片的组织，4 下可保存