分子生物学-03复制

1、Molecular BiologyBiotechnology InstituteHu D第三章 DNA的复制 一、半保留复制 Semi-conservation replication 以每条链为模板，按碱基互补配对原则由DNA聚合酶催化合成新的互补链。二、复制起点和复制子 Origin of replication (ori) and replicon DNA复制从特定位置开始，即复制起点，然后向两边进行复制。 原核生物DNA分子为一个复制子；而真核生物每个DNA分子有多个复制子，每个复制子长约50-200kb。二、复制起点和复制子 Origin of replication (ori) a

2、nd replicon 复制起点有特殊的序列结构： A. 反向重复序列，即回文结构(palindrome)，与复制酶系统的识别有关； B. 启动子序列。 C. 呼吸区序列三、半不连续复制 Semi-discontinuous replication DNA生物合成方向为53延伸合成。 在复制起点向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。 前导链(leading strand)的合成是连续的；后续链(lagging strand)以冈崎片段(Okaxaki fragments)的形式分段合成，再连接。四、参与DNA复制的酶与蛋白螺旋酶 (Helicase) 利用ATP的能量

3、，促使DNA在复制叉打开为单链。 E. coli中一种为螺旋酶I或螺旋酶III，与后续链的模板DNA结合沿53方向运动；第二种为Rep蛋白，和前导链的模板DNA结合沿35方向运动。2 单链DNA结合蛋白(SSBP) E. coli的SSBP为四聚体，可结合32 bp。 SSBP使单链DNA呈伸展状态，有利于单链DNA作为模板。 SSBP防止单链DNA重新配对或被降解。 催化DNA不同超螺旋状态之间的转变。 A. 拓扑异构酶I ：双链解旋 切断形成“酶-DNA“共价中间物 DNA连接。不需辅助因子。 B. DNA旋转酶(DNA gyrase)：拓扑异构酶II，引入DNA分子负超螺旋 。需要ATP

4、。DNA拓扑异构酶 (Topisomerase) 4 引物酶 (Primase) DNA的复制需要RNA引物。E. coli引物酶由dnaG基因编码，60KD，单细胞50-100个分子。 在某些单链噬菌体和质粒DNA复制时，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。引物酶与一般RNA聚合酶的区别：（1）对雷米封不敏感，而RNA聚合酶则敏感；（2）可以利用核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两种底物；（3）只在复制起点处合成RNA引物而引发DNA的复制。 5 DNA聚合酶 (DNA Polymerase, DNA Pol)基本特性：（1）以 dNTP为底物催化合成DNA；（2）需要模板和引物；（3） DNA合成的

5、方向是5 3 。 109kD多肽，每个细胞有约400分子。 模板专一性和底物专一性均较差。 除了聚合酶活性外，DNA Pol I酶还具有： （1）35外切酶活性 （2）53外切酶活性 DNA聚合酶活性和53外切酶活性协同作用，可以进行缺口平移(Nick translation)。AE.coli DNA聚合酶 I (DNA pol I) 120 kD，每个细胞约有100个酶分子，活性为DNA Pol I的5%。 催化特性：(1)补平作用：最适模板为双链DNA中间有空隙的单链DNA部分；(2)具有35外切酶活性，但无53外切酶活性。(3) 可能在DNA的损伤修复中有一定作用。 BE.coli DN

6、A聚合酶 II (DNA pol II) DNA复制所必需的酶；多种亚基，每个细胞中10-20个分子。 具有35和53外切酶活性。35外切酶活性的最适底物是单链是DNA；53外切酶活性要求有单链DNA为起始作用底物，但一旦开始后，便可作用于双链区。 CE.coli DNA聚合酶 III (DNA pol III)功能polpolpol 聚合作用53+ 外切酶活性35+ 外切酶活性53+模板及引物的选择 完整的DNA双链 带引物的长单链DNA+ 带缺口的双链DNA+ 双链而有间障的DNA+一般性质 分子量109 kD120 kD140 kD 每细胞中的分子量40017-10010-20 结构基因

7、polApolBpolC(1) DNA聚合酶a，300kD，4或5个亚基组成，占总量的80-90%，主要负责染色体DNA的复制。(2) DNA聚合酶b，45kD，单链，主要修复核内DNA。D真核生物的DNA聚合酶(3) DNA聚合酶g，140kD，负责线粒体DNA的复制。(4) DNA聚合酶，与原核生物的聚合酶类似，具有35核酸外切酶活性。 除了DNA聚合酶，其它DNA聚合酶均没有35或53外切酶活性。DNA polymerases in human and SV406 DNA连接酶 (DNA lygase) 催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。 (1) 大肠杆菌的

8、DNA连接酶 75kD，对胰蛋白酶敏感，每个细胞中约有300个分子。在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用。(2) 噬菌体T4 DNA连接酶 60 kD，需要ATP。 可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。A原核生物 真核生物DNA连接酶有两型，连接酶I和II。需要ATP参与提供能量。 DNA连接酶I 约为200kD，主要存在于生长旺盛细胞中； DNA连接酶II 约85kD，主要存在于生长于不活跃的细胞(resting cell)中。B真核生物 DNA连接酶 五、DNA复制过程1 复制的引发 (Priming) 包括DNA复制起点双链打开，RNA

9、引物的合成，DNA聚合酶聚合反应开始进行。 转录激活(transcriptional activation) ：RNA聚合酶沿后续链模板转录一短的RNA分子，分开DNA双链；特定序列与引发体结合，并在前导链模板DNA上开始合成RNA引物的过程。 前导链(leading strand)的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质参与，如大肠杆菌的dna A蛋白。五、DNA复制过程1 复制的引发 (Priming) 包括DNA复制起点双链打开，RNA引物的合成，DNA聚合酶聚合反应开始进行。 转录激活(transcriptional activation) ：RNA聚合酶沿后续链模板转录一短的RNA分子，

10、分开DNA双链；特定序列与引发体结合，并在前导链模板DNA上开始合成RNA引物的过程。 RNA引物可能与减少DNA复制起始处的突变有关。 引发过程：DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开合成RNA引物分子，分开双链DNA链单链DNA结合蛋白(SSB)结合在被解开的链上复制因子X(n蛋白)，复制因子Y(n蛋白)，n“蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC蛋白等6种蛋白质组成的引发前体(preprimosome)，与单链DNA结合生成中间物引发前体与引物酶(primase)组装成引发体(primosome)引发体在单链DNA上移动，在dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置引发体首先在前导链

11、上合成RNA引物，然后在后续链上沿53方向不停的移动，在一定距离上反复合成RNA引物。DNA复制的延伸由DNA聚合酶III催化正超螺旋的解除 （1）DNA解链而产生正超螺旋可以被原来存在的负超螺旋所中和； （2）DNA拓扑异构酶I可以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态；而DNA拓扑异构酶II（旋转酶）可以在DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链DNA。这两种机制保证了无论是环状DNA还是开环DNA的复制顺利的解链。DNA生长链的延伸主要由DNA聚合酶III催化，由7种多肽组成。全酶中所有亚基对完成DNA复制都是必需的。亚基具有聚合功能和53外切酶活性，亚基具有35外切酶活性。另外，全

12、酶中还有ATP分子它是DNA聚合酶催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在RNA引物上所必需的，其他亚基的功能尚不清楚。在DNA复制叉处要能由两套DNA聚合酶III在同一时间分别进行复制DNA前导链和后续链。如果后续链模板环绕DNA聚合酶III全酶，并通过DNA聚合酶III，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则后续链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。 当DNA聚合酶III沿着后续链模板移动时，遇到RNA引物后就开始延伸合成。到达前一冈崎片段时停止。复制叉继续向前运动，产生了又一后续链冈崎片段。DNA复制体(replisome)：在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶III全酶分子、引发

13、体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体。复制体在DNA前导链模板和后续链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的后续链。在DNA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶III的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶I通过其53外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由53合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA后续链。DNA复制的终止DNA上也存在着复制终止位点，DNA复制将在复制终止位点处终止，并不一定等全部DNA合成完毕。当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合I所填充。但目前对复制终止位点的结构和功能了解甚少。

14、线性DNA分子两端是靠端粒酶完成其复制。六、DNA复制的真实性 大肠杆菌中，每复制109-1010个核苷酸便要出现一个误差。每1000个细胞经过一次分裂才会插入一个不正常的核苷酸。如果单纯靠碱基对原则来维持其DNA复制准确性的话，那么误差出现的频率将为10-4-10-5。因而，在细胞内除了碱基对原则外，必然还有其他因子的作用，来维持DNA复制的准确性。 DNA聚合酶本身具有校对作用 按碱基配对原则，错误核苷酸掺入的机率为10-4-10-5，然后，DNA聚合酶本身的校对作用又可以使错误核苷酸掺入的机率为10-4-10-5。这样，每掺入一个核苷酸，发生错误的机会只有10-8-10-10。引物RNA

15、的切除 DNA复制开始时掺入的核苷酸往往容易出错。RNA引物可以被切除，不会影响DNA的准确性。 真核生物DNA聚合酶无35外切酶活性。因此，可能存在其他校正机制以保证DNA复制的准确性。七、环状DNA的复制的方式1型复制 环状DNA可以采取上述典型的DNA复制方式进行复制，即从复制起点开始，双向同时进行，形成样中间物，故又称型复制，最后两个复制方向相遇而终止复制。2D环复制 (D-loop)线粒体DNA的复制属于D环复制，即两条链的复制不是同步的。（1）H链首先合成：在复制起点处以L链为模板，合成RNA引物，然后由DNA聚合酶催化合成一个500-600bp长的H链片段。该片段与L链以氢键结合

16、，将亲代的H链置换出来，产生一种D环复制中间物。（2）H链片段的继续合成：上述产生的H链片段由于太短而很容易被挤出去恢复线粒体DNA完整的双螺旋结构。但有时这个片段会继续合成，这需要依靠拓扑异构酶和螺旋酶的作用将双链打开。（3）L链合成开始：以被置换下来的亲代H链为模板开始合成L链DNA，合成也需要RNA引物。（4）复制的完成：H链的合成提前完成，L链的合成随后结束。线粒体DNA合成速度相当缓慢，约每秒10个核苷酸，整个复制过程需要1个小时。刚刚合成的线粒体DNA是松弛型的，需要40分钟将其变成超螺旋型。2滚环复制(Rolling circle)亲代双链DNA的一条链在DNA复制起点处被切开，

17、其5端游离出来并且很快被单链结合蛋白结合。同时环状双链DNA环绕其轴不断的旋转，而且以3-OH端为引物的DNA生长链则不断地以另一条环状DNA链为模板向前延伸。在DNA解链时不会产生超螺旋。当5-端从环上解下来后不久，即与单链结合蛋白结合，以后可移动的引发体便在其上形成，以引发RNA引物的合成，然后由DNA聚合酶III催化合成冈崎片段。 DNA的延伸可以一直进行下去，产生的DNA链可以是亲代DNA单位长度的许多倍。八、不需要RNA引物的DNA复制部分线性DNA病毒的复制不需要RNA引物。复制从DNA的任何一端开始。只能利用一条DNA链作为模板，即以35链为模板。另一条非模板DNA链自身的5和3

18、可以互补配对，然后在3端开始以此链为模板重新合成另一条子链。八、不需要RNA引物的DNA复制所有的腺病毒DNA生长链上都有一个特异的蛋白质分子附着在其5末端的胞嘧啶核苷酸上。在DNA复制开始之前，该末端蛋白质通过共价键与dCMP的5磷酸基相连。胞嘧啶通过碱基配对与腺病毒DNA模板3末端的鸟嘌呤核苷酸配对结合，然后由病毒本身编码的DNA聚合酶以此末端蛋白-dCMP复合物为引物连续合成腺病毒整个基因组的36000个核苷酸。九、DNA的修复(DNA repairing)回复修复 一般能够将DNA修复到原样。光修复 由细菌中的DNA光解酶（photolyase）完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受300-600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。单链断裂的重接部分可仅由DNA连接酶（ligase）参与而完全修复。双链断裂缺几乎不能修复。碱基的直接插入 DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被DNA嘌呤插入酶（insertase）识别结合，在K+存在的条件下，催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键，且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格