临床免疫学和免疫检验荧光免疫技术讲义

1、第八章荧光免疫技术第一节概述荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。一、荧光的基本知识.荧光：荧光就是某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的 光。.发射光谱：发射光谱是指固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品所发射的荧光强度谱图。 激发态电子回到的能级不同，发出的荧光波长就不同。荧光物质在吸收光能后，即刻发射荧光，一旦停止 供能，荧光随即消失。.激发光谱：激发光谱是指固定检测发射光荧光波长，用不同波长的激发光照射样品所记录到的相应 的荧光发射强度谱图。.荧光效率；在一定范围内，荧光强度与激发光强度呈正相关，即激发光越强，荧光越强，但过强的 激发光会使荧

2、光很快褪去。.荧光寿命：荧光物质被激发后产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间称为荧光寿命。.荧光淬灭：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、苯胺、酚、硝基苯等）作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。.荧光偏振。二、荧光物质（一）荧光色素.异硫氟酸荧光素（FITC）:为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或乙醇等溶剂。分子量为389.4kD,最大吸收光波长为 490495nm,最大发射光波长为 520530nm,呈现明亮的 黄绿色荧光。其主要优点是： 人眼对黄绿色较为敏感；通常切片标本中的绿色荧光少于红色荧光。.四乙基罗丹明（RB20。：不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大

3、吸收光波长 为570nm,最大发射光波长为 595600nm,呈橘红色荧光。.四甲基异硫鼠酸罗丹明（TRITC）:最大吸引光波长为 550nm,最大发射光波长为 620nm,呈橙红色 火光。.藻红蛋白（R-R日：最大吸引光波长为 565nm最大发射光波长为 578nm,呈明亮的橙色荧光。（二）其他荧光物质.例系螯合物：其中以 旦3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变 时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。.酶作用后产生荧光的物质：4-甲基伞酮-3 -D半乳糖昔本身无荧光，受3-半乳糖昔酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光。其他如碱性磷酸酶的底物是4-

4、甲基伞酮磷酸盐，辣根过氧化物酶的底物是对羟基苯乙酸等。第二节荧光抗体技术荧光抗体技术是以 荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜下 观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测,或对自身抗体进行定性和滴度测定，此技术亦称荧光免疫组织化学技术。、荧光抗体的制备（一）抗体要求将荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。一般需经纯化提取IgG后再作标记。（二）荧光素要求异硫氟酸荧光素最常用一要求：应具有能与蛋白质分子形成 共价键的化学基团,与蛋白质结合后 不易解离，而未结合的色素及其降 解产物易于清除；荧光效率高，与蛋白质结合后

5、，仍能保持较高的荧光效率；荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；与蛋白质结合后 不影响蛋白质原有的生化与免疫性质;标记方法简单、安全无毒；与蛋白质的结合物稳定，易于保存。（三）抗体的荧光素标记.搅拌标记法：以FITC标记为例。先将待标记的蛋白质溶液用0.5ml/L pH9.0 的碳酸盐缓冲液平衡，随后在磁力搅拌下逐滴加入FITC溶液，在室温持续搅拌 46小时后，离心，上清液即为标志物。此法适用于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短、荧光素用量少。但本法的影响因素多， 若操作不当会引起较强的非特异性荧光染色。.透析法：适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特

6、异染色也较低。方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含 FITC的0.01mol/L pH9.4 的碳酸盐缓冲液中反应 过夜，以后再对 PBS透析法去除游离色素。低速离心，取上清液。（四）荧光素标记抗体的纯化抗体标记完成后，还应对标记抗体作进一步纯化，以去除未结合的游离的荧光素。纯化方法可采用透析法或层析分离法。（五）荧光抗体的鉴定.荧光素与蛋白质的结合比率荧光素与蛋白的 过量结合是非特异荧光着色的来源之一，而未结合者有抑制特异性荧光抗体反应的作用。荧光素结合到蛋白上的量的重要指标是荧光素与蛋白质的结合比率（F/P）。荧光素与蛋白质的结合比率（F/P）是指荧光素（F）结合到抗体蛋白（

7、P）上的量。F/P比值越大，表明抗体分子结合的荧光素越多，反之则结合越少。一般用于组织切片的荧光抗体,其F/P=1.5为宜,用于 活细胞染色 以F/P = 2.4为宜。.抗体效价 可以采用 双向免疫扩散试验测定，抗原含量为1g/L时,抗体效价 1:16者较为理想。.抗体特异性 吸收试验：向荧光抗体中加入 过量相应抗原 反应后,再用于阳性标本 染色,应不出现 明显荧光； 抑制试验：阳性标本 先与相应未标记抗体反应 ，洗涤后，再加荧光抗体 染色,荧光强度应受 到明显抑制。（六）荧光抗体的保存防止抗体失活和防止荧光淬灭。最好小量分装，-20 C冻存可保存23年。真空干燥后可长期保存。稀释后的抗体不宜

8、长时间保存，在4c可保存13天。二、标本的制作组织材料可制备成石蜡切片（较少用）或冷冻切片，切片要求尽量薄些，以利于抗原抗体接触和镜检。组织标本也可制成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切面，使玻片粘上12层组织细胞。细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀。过程中应保持抗原的完整性，并在操作中不发生溶解和变性，也不扩散至邻近细胞或组织间隙中去。、荧光抗体染色与结果判断荧光抗体与抗原反应，一般在2537C, 30分钟,不耐热抗原的检测则以 4 c过夜为宜。（一）直接法：用特异荧光抗体直接滴加于标本上。本法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素 少；缺点是敏感度偏低，需制备特异性的荧光抗体。（二）间接

9、法：可用于检测抗原和抗体，普通一抗+荧光二抗。灵敏度高，仅需一种荧光抗体。（三）双标记法：FITC及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。（四）荧光抗体染色结果判断：在每次实验时均需设立严格的实验对照（阳性和阴性对照）。阳性细胞的显色分布有胞质型、胞核型和膜表面型三种类型 。临床上根据特异性荧光强度达“+”以上判定为阳性。“-”为无或仅见极微弱荧光；“+”为荧光较弱但清楚可见；“+”为荧光明亮；“+”为耀眼的强荧光。四、荧光显微镜的基本结构免疫荧光显微技术的基本原理是荧光抗体与待测标本中的组织或细胞抗原结合后，在荧光显微镜下观 察，在黑色背景上可见明亮的特异性荧光即可对标本中的抗原

10、物质进行鉴定。（一）光源 由于荧光物质的量子效率极低，要有一个很强的激发光源，通常用高压汞灯、氤灯或卤素 灯作为激发光源。（二）滤光片 滤光片的正确选择是获得良好荧光观察效果的重要条件。滤光片分为隔热滤光片、激发 滤光片和吸收滤光片。.隔热滤光片位于灯室的聚光镜前面，能阻断红外线的通过而隔热。.激发滤光片位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长的光域，以提供合适的激发光。.吸收滤光片 位于物镜和目镜之间，作用是阻断激发光而使发射的荧光透过，使标本在暗的背景上呈 现荧光易于观察，也使眼睛免受强激发光刺激。（三）光路分为透射光和落射光两种形式。（四）聚光器 聚光器有明视野、暗视野和相差荧光

11、聚光器等。（五）镜头 目镜有氟处理、消色差和复消色差三类镜头，常用的是消色差镜头。 第三节荧光免疫分析的类型荧光免疫测定是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特 异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。一、时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）用弱系元素标记抗原或抗体，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨。（一）基本原理.时间分辨：正常组织在激发光照射下可以发出一定波长的荧光,干扰检测结果。但该荧光寿命较短（110ns）,而例系元素螯合物的荧光寿命较长（101000 ps）。故待短寿命背景荧光完全衰变后再测定翎系元素离子

12、螯合物的特异性荧光信号。. Stokes位移:选择荧光物质作为标志物时，必须考虑激发光谱和发射光谱的波长差 ，即Stokes位移。.发射光谱和激发光谱：例系元素发射光谱带较窄，多在613nm土 10nmi利用滤光片只允许此波段的荧光通过，避免干扰。.荧光标记物的相对比活性：比活性是指单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。.信号增强：Eu3+标记抗原抗体复合物在弱碱性溶液中被激发后的荧光信号较弱，加入一种酸性增强液可使Eu3+从复合物上完全解离下来，并与另一种螯合剂所螯合，以增强荧光信号。（二）标记物和标记方法.标记物：用于时间分辨荧光免疫测定的标志物是例系元素，包括铺（Eu）、彭（Sn3+

13、）、钺（Tb3+）、铉（NcT）和镐（Dys+）等，它们的荧光寿命较长，尤其是 Eu和Tb3+的荧光寿命特别长且荧光强。多用 Eu3 +和Tb3+为标记物，其中 Eu=最为常用。.标记方法：例系元素离子不能直接与抗原或抗体结合，需应用具有双功能基团的螯合剂，其一端与翎系元素离子结合，另一端与抗原或抗体蛋白分子上的氨基结合，形成翎系元素离子-螯合剂-抗原（或抗体）复合物。（三）方法类型.双抗夹心法.固相抗体竞争法：待检抗原和Eu3+标记的抗原 与固相抗体发生竞争结合,所测得的荧光强度与待检抗原含量成反比。.固相抗原竞争法：待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，所测得的荧光强度与待检抗

14、原含量成反比。（四）方法评价.优点：灵敏度高；分析范围宽；标记结合物稳定，有效使用期长；测量快速，易自动化；无放射性 污染。.缺点：易受环境、试剂和容器中的翎系元素离子的污染，使本底增高。二、荧光偏振免疫测定利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与其抗原抗体复合物的荧光偏振程度的差异，测定体液中小分子物质 的含量。（一）基本原理当光线通过偏振滤光片后，形成只有一个方向的平面光，称之为偏振光。荧光物质经单一平面的偏振 光（蓝光，485nm）激发后，可吸收光能并发射出相应的偏振荧光（绿光，525550nm）,偏振荧光有很强的方向性。荧光偏振免疫测定常用异硫氟酸荧光素 （FITC）标记小分子抗

15、原。（二）方法评价荧光偏振免疫测定样品用量少；荧光素标记结合物稳定，使用寿命长；方法重复性好；快速，易自动 化；试剂盒专属性强,适于检测小分子和中等分子物质，不适宜测定大分子物质；灵敏度较非均相荧光免疫测定法低。三、荧光酶免疫测定利用酶标抗体（抗原）与待检抗原（抗体）反应，借助酶反应荧光底物，经酶促反应生成稳定且高效 的荧光物质，通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量。（一）基本原理：以碱性磷酸酶（ALP）标记抗体（或抗原），以固相载体包被抗原（或抗体），碱性磷酸酶分解荧光底物 4-甲基伞酮磷酸盐（4-MUP）形成4-MU,经360nm激发光的照射，发出 450nm的荧光。（二）方法类型.双

16、抗夹心法：固相抗体和碱性磷酸酶标记抗体与待检抗原反应，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物4-MUP荧光强度与待检抗原含量成 正比。.双抗原夹心法：用固相抗原和酶标记抗原与待检抗体反应，生成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复合物，洗涤除去未结合部分，加入底物进行酶促发光，荧光强度与待检抗体含量成正比。.固相抗原竞争法： 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤除去未结合部分，固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待检抗原含量成反比。（三）方法评价由于使用酶和荧光底物的化学反应作为放大系统，故灵敏度大大提高。但血清和其他生物样品的背景 荧光会干扰测

17、定，因此用固相荧光酶免疫测定法效果好。第四节荧光免疫技术在医学检验中的应用一、荧光抗体技术的应用.自身抗体检测 检测血清抗核抗体、抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体等自身抗体，辅助诊断自身免疫性 疾病。.病原体检测 荧光抗体技术可快速鉴定病原体并可检测血清中抗体,用于疾病诊断、流行病学调查和 临床回顾诊断。.免疫病理检测 可用于组织中免疫球蛋白、补体和抗原抗体复合物的检测及肿瘤组织中肿瘤特异性抗原的鉴定。.细胞表面抗原和受体检测可用于淋巴细胞表面 CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。.流式细胞分析 将游离细胞作荧光抗体染色后，经单色激光照射后发出的荧光信号由

18、荧光检测计检 测。二、荧光免疫测定的应用.时间分辨荧光免疫测定：用于蛋白质、激素（肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等）、药物、肿 瘤标志物、病原体抗原/抗体等测定。.荧光偏振免疫测定：适用于血清或尿液中小分子物质的测定，如药物、维生素、激素。.荧光酶免疫测定：可用于多种抗原抗体的检测，如病毒抗体、细菌及毒素抗原、激素、肿瘤标志物、 过敏原、心肌损伤标志物和凝血因子等。【习题】临床中最常用的荧光色素是A.异硫氟酸荧光素B.四乙基罗丹明C.四甲基异硫鼠酸罗丹明D.例系螯合物E.藻红蛋白正确答案 A答案解析临床中最常用的荧光色素是异硫氟酸荧光素。最早被用作标记免疫技术中标记物的是A.酶B.放射性核素

19、.火光系D.金颗粒E.化学发光剂正确答案C答案解析最早被用作标记免疫技术中标记物的是荧光素。一般用于固定标本的荧光抗体的荧光素与蛋白质结合比率（F/P）值应为A.0.5B.1.0C.1.5D.2.0E.2.4F/P= 1.5为宜，用于活细胞染色以F/ P= 2.4为宜。正确答案C答案解析一般用于组织切片的荧光抗体，其用于活细胞染色的荧光抗体的荧光素与蛋白质结合比率（F/P）值应为A.0.5B.1.0C.1.5D.2.0E.2.4正确答案E答案解析一般用于组织切片的荧光抗体，其F/P= 1.5为宜，用于活细胞染色以F/ P= 2.4为宜。在荧光素标记抗体技术中，荧光素与抗体之间的结合靠的是A.范

20、德华力B.氢键C.离子键D.共价键E.静电引力正确答案D答案解析在荧光素标记抗体技术中，荧光素与抗体之间的结合靠的是共价键。荧光抗体技术中，临床上常用的只需一种标记抗体即可检测多种抗原的方法是A.直接法B.间接法C.补体结合法D.双标记法E.荧光偏振免疫法正确答案B答案解析间接法 可用于检测抗原和抗体。本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。本法灵敏度高，而且在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。用间接法免疫荧光技术检测组织中的抗原，应将荧光素标记A.抗原B.相应抗体C.抗免疫球蛋白抗体D.抗原-抗体复合物E.抗C3抗体正确答案C答案解析用间接法免疫荧光技术检测组织中的抗原，应将荧光素标记抗免疫球蛋白抗体。目前临床上细菌菌种鉴定应用较多的方法是A.ELISAB.放射免疫技术C.化学发光法D.荧光抗体技术E.金免疫技术正确答案D答案解析目前临床上