山银花含量分析方法确认方案

1、 9/15山银花含量分析方法确认方案方案编号：JYYZFA- 09 - 00起草 日期审核 日期批准 日期上海松华药业有限公司目 录一、确认方案概述 3二、确认范围和目的 3三、确认组织及分工 3四、确认进度计划 4五、前期准备及确认相关支持 4六、确认方式 5七、确认实施项目及内容 5八、确认过程及结果详见此方案配套验证报告 11九、确认过程偏差 11十、再确认或验证时间及建议 11十一、附件 11附件1参加人员会签及验证结论12附件2 验证小组培训记录 13一、确认方案概述:传统中药饮片山银花为中国药典长期收载品种，几次药典修订此品种的含量测定方法及实验条件均未变动。采用HPLC-UV-E

2、LSD联动测定山银花中绿原酸 、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量。根据GMP要求，企业应对变更后的检验方法进行方法确认，以确保检验数据准确、可靠。为了确保此检验条件的准确性和符合性特依据中国药典分析技术检测技术指南及药品GMP指南、2015版中国药典四部、一部相关部分要求结合上海市食品药品检验所中药室老师指导起草此确认方案。对检验方法进行确认，以确保产品质量。二、确认范围和目的本方案适用于2015版中国药典一部山银花含量项下所涉及的相关内容。1.通过确认证明现行药典所采用的方法适合于相应的检测要求，保证该方法在我公司实验室具有良好的适用性。2.确认公司所配备硬件、软件即实验仪器、设备及人员

3、符合并熟练撑握此实验标准操作规程。3.确认过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写确认方案变更申请及批准，报验证小组批准。三、确认组织及分工姓名部门确认分工李志勇质量部负责对确认中出现的问题提出指导意见，负责审核批准报告。韩子佩QA部负责审核确认方案、确认报告。刘润雅QC部负责起草确认方案，协调确认试验安排及实施，收集各项确认、试验记录，并起草确认报告。协助完成试验徐婷、韩晓凤QC部含量检验方法确认的实施。四、确认进度计划2019年06月03日2019年06月30日五、前期准备及确认相关支持5.1方案培训参与本次方法确认的人员均应过该方案的培训，培训记录表见附件。5.

4、2文件资料（1）相关SOP文件资料方法确认所需文件序号文件名称文件编号生效日期是/否现行版文件1岛津高效液高效液相色谱仪标准操作程序是 否2CP124S电子天平标准操作程序是 否3Varian380-LC蒸发光散射器标准操作程序是 否4金银花露检验操作检验规程是 否（2）所有与确认有关的仪器、仪表、计量器具应进行过校验，并达到合格要求。仪器仪表检定记录序号仪器型号/名称仪器编号校验日期是/否在有效期内1岛津高效液相色谱仪是 否2Varian380-LC蒸发光散射器标准操作程序是 否3CP124S电子天平是 否4BT 25 S精密电子天平是 否5容量瓶（ ）是 否6移液管（ ）是 否（3） 对照

5、品、供试品及试剂及耗材信息名称批号来源取用量对照品绿原酸灰毡毛忍冬皂苷乙川续断忍冬皂苷乙供试品山银花山银花试剂乙腈乙酸甲醇色谱柱六、确认方式依据法规药品GMP指南之分析方法验证和确认要求，采用方式一进行：即，由两名检验人员分别独立对同一批产品（如必要用不同仪器）进行检验。比较两人检测关键项目及结果来证明方法在本实验室的适用性。七、确认实施项目及内容7.1 确认前准备 7.1.1色谱条件与系统适用性试验：7.1.1.1固定相：十八烷基硅烷键合硅胶。流动相：A相：乙腈 B相：0.4%醋酸溶液按下表进行梯度洗脱时间（分钟）流动相A（%）流动相B（%）01011.51588.5851012121818

6、301529293333458164716767557.1.1.2检测条件：UV 绿原酸检测波长：330nm。 ELSD 皂苷用蒸发光散射器检测。7.1.1.3 理论板数：按绿原酸峰计算不低于1000。7.1.1.4 开启仪器并按上述色谱条件及工作站界面要求进行各项参数设定与系统预平衡。7.1.2 对照品溶液配制： 精密称取绿原酸对照品约12.5mg、含灰毡毛忍冬皂苷乙对照品约15mg，置25ml棕色量瓶中，另取川续断皂苷乙对照品约10mg，置10ml棕色容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，精密量取5ml至上上述25ml棕色量瓶中加50%甲醇定容，制成每1ml含绿原酸0.5mg、含灰毡毛忍冬皂

7、苷乙0.6mg和川续断皂苷乙0.2mg的混合溶液，即得。7.1.3 供试品溶液配制： 取供试品粉末(过四号筛)0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率300W，频率40kHz）40分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。7.1.4 计算公式1：绿原酸：y=ax+b 式中：y为对照品或样品峰面积或峰高； x为对照品或样品的进样质量。公式2：两皂苷：LgA=aLgC+b式中： A为对照品或样品峰面积或峰高； 7.1.4 检验结果判定本品按干燥品计算，含绿原酸（C16H18O9）不少于2.0%,含灰毡毛忍冬皂苷乙

8、(C65H106O32) 和川续断皂苷乙(C53H86O22)的总量不得少于5.0。即为符合规定。7.2专属性确认分别精密量取阴性对照溶液、对照品溶液、及供试品溶液各10l，依次注入液相色谱仪，按照上述色谱条件进行测定。可接受标准： 1、HPLC：检测波长330nm：供试品溶液中绿原酸保留时间与对照溶液中绿原酸峰保留时间一致。绿原酸峰理论塔板数不低于1000。2、ELSD阴性对照图谱中无干扰色谱峰；对照品色谱与供试品色谱峰中灰毡毛忍冬皂苷乙峰与川续断忍冬皂苷乙相应位置上无干扰色谱峰，且出峰保留时间一致。 表2绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的专属性结果 项目名称 保留时间R第一人检测结果

9、第二人检测结果对照品样品对照品样品绿原酸灰毡毛忍冬皂苷乙川续断忍冬皂苷乙结论汇总人/日期： 复核人/日期：7.3 准确度 （两点法通过线性关系）考察7.3.1待系统平衡后将混合对照品溶液按上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液2ul、|10ul,为一组数据；2ul、|10ul结合 4ul、|8ul,为第二组、分别进样2针（可跟据验证实际情况做合法调整），观察测定各峰面积。绘制标准曲线，其中绿原酸以峰面积 Y对绿原酸对照品浓度 X进行线性回归,而灰毡毛忍冬皂苷乙与川续断皂苷乙则分别以峰面积 Y对相对应的对照品浓度 X的 log对数进行线性回归。3个成分的线性方程见表 3。可接受标准：标准曲线线性良

10、好，且R20.999表 3绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的线性方程：名称第一人检测第二人检测检验员检验日期色谱柱信息实验组别信息第一组第二组第一组第二组 检测结果成分线性方程R2线性方程R2线性方程R2线性方程R2绿原酸灰毡毛忍冬皂苷乙川续断忍冬皂苷乙结论产品批号： 汇总人/日期： 复核人/日期： 15/157.4精密度7. 4.1重复性精密吸取样品溶液各510L,按上述色谱条件连续进样 5次 ,测得绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙峰面积的记录色谱图RSD(n=5)实验结果分别汇总附件）。可接受标准：5针主峰峰面积RSD不大于2%。ELSD主峰峰面积RSD不大于5%符合标准表明仪

11、器精密度良好， （由于ELSD检测器性能所限如遇个别参数超标可视风险而判定）。名称测定结果RSD12345平均绿原酸灰毡毛忍冬皂苷乙川续断忍冬皂苷乙结论表4 含量精密度（重复性）测定结果汇总人/日期： 复核人/日期：7. 4.2中间精密度及稳定性由两名实验员在不同天，分别用同一批对品溶液及配制供试品溶液，按上述色谱条件，分别进样分析，将实验结果分别汇总相应附件。表5含量中间精密度测定结果供试品批号： 名称第一人检测第二人检测检验员检验日期仪器编号色谱柱绿原酸灰毡毛+川续断两次相对平均偏差绿原酸灰+川结论汇总人/日期： 复核人/日期：7.4.3样品测试（测试过程及实验信息详见配套报告）可接受标准

12、：按药典山银花项下标准判定其是否合格。7.4.3.1实验样品测试；选用确认批次山银花YG05- 按现行药典方法测试。7.4.3.2重现性测试；选用确认批次山银花YG05- 按本方案确认方法委托第三方进行测试结果同本单位结果进行比对，证明仪器及方法的重性。7.5耐用性7.5.1应用HPLC-UV-ELSD法进行山银花含量测定的方法学考察过程中，发现ELSD 检测器的漂移管温度和载气流速对仪器的基线噪音和被测样品的响应值影响较大，最佳的参数应该是可接受噪音的最低温度和获得最大检测响应值的最低气体流量。本试验通过分别逐渐改变漂移管温度和雾化器气体流量，记录峰面积的变化，选择了最优的温度和载气氮气的流速，漂移管温度、载气流量 确定最佳的实验条件（见配套报告）。八、确认过程及结果详见此方案配套验证报告九、确认过程偏差在确认实施过程中发现的偏差必须进行记录和分析（表6）。内容要包括：偏差的表现、查找引起偏差的原因及查找过程、偏差分析的结果、此偏差是否对验证结论有影响、有何影响。偏差概述引起偏差的原因及查找过程偏差分析及解决方案纠正和预防结论确认人员/日期审核人员/日期批准人员/日期偏差调查处理报告（表6）十、再确认或验证时间及建议10.1法定相关检查标准修改后需要对本方法重新进行验证或确认；10.2检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应重新验证。十一、附件 11.1相关实验