免疫学基础及试验技术修

1、免疫学基础及实验技术修免疫学基础及实验技术实验报告姓名姚丽君专业针灸推拿学年级2002年研究生实验室免疫试验室 时间 2003年1月12日教师李永念老师免疫学教研室人血清I 的提取及鉴定一.主要原理（一）离子交换层析提取人 血清I gG离子交换剂采用 DEAE-纤维素，是表面交联有二 乙基乙胺基团的纤维素，本身带有真电荷，能吸附阴离子。DEAE-纤维素悬浮在 PH高于6.5,克分子浓度低的缓冲 液内，置备成层析柱。人血清经过 PH7.4磷酸缓冲液透析平衡后，其中的 IgG 不带电荷或仅带少量电荷，其他的蛋白质则主要带负电荷， 这样的血清样品通过相同缓冲液平衡好的DEAE-纤维素柱，除IgG以外

2、的血清蛋白都吸附在柱上，仅IgG最易形成吸附-解离-再吸附-再解离的状态，因此能随洗脱液一起最早从柱 中流由，收集洗脱液获得 IgG o（二）血清I鉴定以收集的洗脱液为抗原， 与兔抗人IgG 做琼脂双扩散实验，可根据沉淀线的形成确定IgG抗原性。用免疫电泳法使血清中各种蛋白的分子大小以及电荷状 态、电荷量均有差异，因而它们的泳动速率也不相同，根据 在凹槽中加入免抗人血清，上下两孔加入用蔗糖包埋法进行 浓缩后的浓缩液和正常人血清，经一段时间后由现沉淀弧， 根据沉淀弧的情况来检测所获的IgG的纯度。用754型分光光度计于 280nm紫外光源测定洗脱液光密 度值，根据IgG的E1cm114.3OD公

3、式，可计算由收获的IgG 含量，并推算由所获得IgG的百分率。二. 主要材料 1. 0.5N NaOH、0.5N HCL、0.85NaCL 按常规配制 2. DEAE-纤维素 健康人全血 3. PH7.4 0.01M 磷酸缓冲液4. 20三氯醋酸水溶液按 W/V比例配制5.蔗 糖（研成细粉状）6. PH8.6 0.025MBA巴比妥纳-巴比妥缓冲液，2M NaCL水溶液7. 1.5琼脂凝胶8.布氏漏斗、 抽滤瓶、水泵、试管，烧杯，玻璃棒，滤纸试纸、蝴蝶铁架、 透析袋、离心机，746-电泳仪、754型分光光度计三、操作步骤（一）DEAE-纤维素预处理 1、称取DEAE- 纤维素12克，均匀撒在事

4、先盛有 150ml 0.5NNaOH的烧杯 中，人其自由沉降，放置4 0 - 5 0分钟，不时地用玻璃棒 轻轻搅动。2、将湖状物移入垫有滤纸的布氏漏斗中，连接漏斗抽 滤瓶，并用水泵抽干糊状物。立即将 DEAE-纤维素移入烧杯中，加蒸储水，浸泡 20-30min并不时搅拌，再移入漏斗抽干，如此重复，至洗由 的PH值等于8即可。将交换剂移入 150ml 0.5N HCL中放置40-50min , 不时轻轻搅动，移入布氏漏斗抽滤，再依同法用 0.5N NaOH 处理一次，时间不超过 50min。4、重第2项操作，至抽滤液 PH值等于8即可，最后PH7.4 0.01MPB液浸泡交换剂，抽干，再重复一次

5、，然后将 交换剂用相同PB调成糊状，保留至装柱。装柱、平衡1、固定层析柱在蝴蝶铁架上，垂 直。柱上方放置PH7.4 0.01MPB液的洗脱瓶，以乳胶管相连， 柱底部有细胶管，装止水夹，调节流速。2、将上糊状物倾入柱中，打开柱底流由口，用烧杯接 流生液，注意不能断层，纤维素中不允许进空气，柱上表面 要平，上部要留有约 3cm高空间。上样和洗脱1、 将人血置离心机以 2000rpm, 10min离心，取由并用毛细吸管吸取10 ml人血清装入透析袋,于烧杯内浸入40倍于血清体积的起始缓冲液中，置4 C冰箱内透析过夜，中途更换两次缓冲液；2、打开柱上端塞子，用带有橡皮乳头的毛细吸管吸由交换剂表面的缓冲

6、液， 至仍2mm厚的液面，以免空气进入；3、用清洁细吸管将已 平衡好的血清样本原柱管内壁缓缓加在纤维素柱表面，调节 流速，使样品进入交换柱内，约 3ml/10min; 4、待液面还约 2mm厚的样品时，用少量起始 PB冲洗柱内壁，到 PB进入 交换剂仍留有2mm后液面时，再冲洗二次，保持柱面平整；5、 最后加适量起始缓冲液，连接洗脱瓶，流速调至 30-40ml/cm2/h ; 6、收集洗脱液与试管中，每管 5ml,共收集12管并从各管中取1-2滴，力口 20三氯醋酸1-2滴检测。洗脱液抗原性鉴定 1、用1.5琼脂凝胶制版， 根据下图用打孔器打孔 2、加样中心孔加入兔抗人IgG,从 收集的12管

7、洗脱液中用毛细吸管吸取洗脱液分别加入周围 六孔，每孔所加样品的量以液面与孔测平齐为准；3、将琼脂板置湿盒内37 c温箱孵育24小时，观察结果。（五）IgG纯度鉴定1、琼脂板制作用1. 5琼脂凝胶 加热融化后倾注在载玻片上，玻片上放一条细玻棒，等凝胶 凝固后在玻棒上下两侧打孔，制成如图所示2、洗脱液的处理将通过离子交换层析法收集的12管洗脱液，用754型分光光度计测各管洗脱液在波长280nm的光密度值，第一个蛋白峰为IgG,收集有IgG活性的三管洗脱液，混合后装于 透析袋内，用蔗糖粉末将其包埋使其浓缩；3、加样如图示上孔加入浓缩的IgG提取液，下孔加入正常人血清，将加 样后的琼脂板置于 746-

8、电泳仪上，用四层纱布条做桥，连接 凝胶板与电极缓冲液。该桥搭在凝胶上部分约 5mm ,尽量拉直，与胶面间不能 有气泡；4、连接电源，调节指示电压至100V （端压约为5V/cm）,电泳槽加盖后，电泳至血清蛋白迁移至距正极段边 缘1cm处，关闭电源； 5、凝胶板与桌面，取由玻条，凝 胶中部既成一长槽，加兔抗人全血清加入槽内与胶面水平；6、置凝胶板与湿盒内，于37c或室温中孵育，12小时观察沉淀弧由现的情况。7、计算回收率取透析袋内浓缩的提取液，用 754型分 光光度计测波长280的光密度值，如果超生测定范围，稀释 后再测，按浓缩后IgGmg/mlOD2801.43回收体积，正常人血 清IgG12

9、mg/ml收集的血清体积，回收率浓缩IgG/正常人血清IgG ,计算回收率。四、实验结果1、DEAE-纤维素洗脱，收集洗脱液12管, 均为略带黄色的液体，取样添加20三氯醋酸，各管中仅第4、 5管由现浑浊，表明试管洗脱液中含蛋白质。其余管未见明显反应。2、745型分光光度计测由12管洗脱液的光密度 （OD） 值如下 管数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A280 0.024 0.032 2.85 3.04 2.65 0.66 0.192 0.155 0.133 0.113 0.110 0.110 做 A280 光 密度值峰值曲线图如下A280 （试管数）a经过蔗糖粉末包埋

10、后，收集到浓缩的IgG为3.5ml,测其OD值为3.52, 此值已经超生光密度计测定范围，取 0。5ml浓缩液加2.5ml生理盐水稀释5倍后测OD值为2.52。b按下列方法计算IgG 回收率 浓缩后 IgGCmg/mlOD2801.43 体积（3. 55）正常人血清 IgG12mg/ml 体积8ml回收率浓缩IgG/正常人血清IgG 2.521.433.55/12865.69 3、向琼脂扩散试验结果如下图，有白色成沉淀线由 现，彼此相互融合相连。4、疫电泳（纯度鉴定）如下图，有沉淀弧由现，提取 液与抗人全血清之间只由现一条沉淀弧，并靠近凝胶板负极 端，说明所提取IgG为纯品。人血清与抗人血清之

11、间由于存在多抗原抗体成分，所以 由现多条沉淀弧。五、分析与讨论IgG是一种具有抗体活性的免疫球蛋白， 其具有一般蛋白质的通性，是再次体液免疫应答产生的主要 Ig。IgG主要由脾脏和淋巴结中浆细胞合成，含量高（在血清中含量最高），分布广，它能与抗原特异性结合，从而在体 内介导多种生理和病理效应。本次试验是利用离子交换剂的特性，血清中IgG不带电荷或仅带少量电荷，其它的蛋白质则主要带负电荷，使人血 清通过带阳离子 DEAE-纤维素制成的交换剂，带负电荷的蛋 白质与阳离子交换剂结合，而不带电荷的IgG处于游离状态， 用PH7.4的磷酸缓冲液通过层析柱， 未结合的IgG随洗脱液 一起流由，试管收集，这

12、样使血清样品通过 DEAE-纤维柱而 得以分离由IgG。收集的洗脱液颜色略带黄色，可能是收集血清时吸入了 破碎的红细胞。在加入三氯醋酸后4、5管由现沉淀，说明从第 4管开始 有大量的IgG存在，IgG峰值集中在3、4、5三管，并峰值 上升和下降很快，未见馒头峰，证明洗脱较好。本次试验已成功地收集了IgG。从双向琼脂扩散试验的结果看，中间孔抗人IgG与周围孔的提取液IgG之间的凝胶由现一条白色沉淀线， 3、4、5 孔之间形成的沉淀线相互吻合，这说明 IgG与抗体抗人IgG 浓度相当，提取液为单一抗原，即 IgG。通过免疫电泳结果看在滴加浓缩提取液的一测由现一条 沉淀弧，说明浓缩提取液中只有一种抗

13、原物质，而在滴加正 常人血清的一测由现多条沉淀弧，说明正常人血清中存在多 种抗原物质。所以，通过以上两个试验证明经分离提取的为纯IgG。根据回收率看本实验的提取及回收比较有效，亦可根据公式计算IgG的浓度为18.018mg/ml。实验七抗体形成细胞的检测一、脾细胞介导的羊红细胞分光光度计定量测定法(QHS)二、主要原理将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾脏制成细胞 悬液，与一定量的绵羊红细胞在试管内混合，加入适量补体，在水浴中孵育一定时间，在补体的参与下，引起抗体形成细胞周围的绵羊红细胞溶解，而且溶血的程度与脾细胞中的抗 体形成细胞总数有一定的关系，与抗体形成细胞所分泌的抗 体量有关，但不能反映单个抗体

14、分泌细胞的数量。因抗体形成细胞上有抗绵羊红细胞抗体，与绵羊红细胞结合，在补体的激活下，绵羊红细胞溶解，故抗 SRBC抗体 又称溶血素。通过一定量SRBC完全溶解的最高血清稀释度得到溶血 素的效价。QHS法可用于检测药物对 SRBC诱导抗体产生过程是否 有刺激作用和抑制作用。三、主要材料1、 SRBC保存液，预先洗三次，配置为 0.5、1浓度的SRBC 2、Balb/c小鼠（体重25左右，雌雄随 机），免疫与未免疫小鼠各 6只3、0.01M PH7.2 PBS （含Ca2, Mg2）,生理盐水 4、补体（预先制备好的，需稀释 成130）,荧光标记的免疫小鼠IgG 5、其他水浴箱、离心机、 试管、

15、玻片、毛细吸管、组织研磨器等四、操作步骤 1、先摘除免疫小鼠的眼球，收集血液于 清洁干燥试管内，待血液凝固后，置恒温箱37c内30min,血清析生，并收集与小管保存，以备测溶血素；2、颈椎脱臼处死小鼠，暴露腹腔，用 PBS清洗，用组织研磨器研磨置备单细胞悬浮液（每个脾脏加5mlNS）,然后离心（2000转/分）10min,弃上清夜，再加生理盐水离心，如此重复 3次， 各管最后留下的沉淀分别加生理盐水至8ml备用；3、取6个试管，设1、2、5号为免疫后的小鼠，3号为未免疫小鼠，4、6号不装入脾细胞，然后按如下操作，混匀，置 37 c水 浴箱30min ,目测结果如下 单位（ml）编号 脾细胞（5

16、106） /ml SRBC （0.5） 补体（130） PBC 目测结果 1-2 1 （免疫 鼠）1 1清3 1 （未免疫鼠）1 1 混浊4 1 1 1混浊5 1（免疫鼠）11混浊6 1 2混浊4、溶血素效价的测定1取前血清制备测血清，离心； 2取前制备免疫小鼠，取0.1ml于第一试管中，再加入0.9NS 1ml,混匀从中取0.5ml 加入第二个试管中，再加 0.5mlNS,混匀，取0.5ml加入第 三管中，继续如此加至第 9管，稀释后取由0.5ml丢弃，最后一管只加NS,然后再于各管中加入 0.5ml补体（130）和 0.5ml 1SRBC,摇匀，于37c水溶30min ,取由后看结果。方法

17、与结果如下 管数1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 对照组 小鼠血清 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 0.5 - NS 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 补体 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 1RBC 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5结果血清稀释度 110 120 140 1801160 1320 1640 11280 12560注完全溶血用完全不溶血3依同样方法做未免疫小鼠各 10管，其结果为完全不溶血，液体混浊五、讨论与分析 脾细胞介导的绵羊红细胞分光光度计定 量测定法运用了细胞溶血反应来检测溶血的程度与抗体形 成细胞总数及所分泌抗体量的关系。抗原和抗体结合形成抗原-抗体复合物，抗体较链区构型 改变，使Fc段的补体结合部位暴露，补体 C1与之结合，通 过经典途径激活补体系统，形成攻膜复合体，并在细胞膜上 形成小孔，使小的可溶分子、离子