生物化学A（上）11-核酸化学2-DNA的结构和特性

1、DNA的结构与特性Structure and Characters of DNAWatson-Crick的DNA双螺旋2.0 nm结构特征双螺旋分子中糖分子与纵轴平行，与碱基平面垂直。稳定双螺旋结构的作用力为氢键和碱基堆积力（即疏水作用）。DNA的三级结构DNA的大小：噬菌体T2DNA长约50 mE-coli DNA 长约1 mm人生殖细胞DNA长约1 mDNA的分子形状原核生物的基因组DNA（即染色体）、质粒（plasmid）DNA、一些病毒DNA、线粒体及叶绿体DNA，呈环状双链（double stranded cyclic DNA, DSCDNA） 。真核生物的染色体DNA，大部分噬菌体

2、DNA，和一些病毒DNA，呈线状。共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）的超螺旋结构（superhelical structure） 形成超螺旋的基础: DNA双螺旋的扭曲形成超螺旋（superhelix） 超螺旋：指双螺旋环状分子再度螺旋化即成为超螺旋结构。自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来，现已知道绝大多数原核生物的DNA都是共价（封）闭环（covalently closed circle, 简称cccDNA 分子）。对于真核生物来说，虽然其染色体上多为线形DNA分子，但其DNA均与蛋白质结合，

3、两个结合点之间的DNA形成类似CCC分子的环结构（loop），同样具有超螺旋形成。环状DNA引发的拓扑学问题拓朴学（topology）是专门研究物体变形后仍然保留下来的结构特性。噬菌体DNA在不同的生活周期可以以环形或线形存在，线状DNA的两端有粘末端，有助于DNA连接酶将互补的粘末端连成环状。其中会带来拓朴学的问题。一段长260 bp的B-DNA，周期数为25，把它们连接成环，此时的DNA为松弛型DNA。若将上述DNA先拧松2周后再连接成环，可以形成两种环形DNA，一种称解链环形DNA（螺旋周数23）和突环。另一种为超螺旋DNA，螺周数仍为25，但同时具有2个超螺旋周。从力能学看，超螺旋更易

4、形成。超螺旋DNA具有更为致密的结构，可以将很长的DNA分子压缩在一个较小的体积。生物体的DNA绝大多数是以超螺旋形式存在的。超螺旋DNA密度较大，离心场中较线形或开环DNA移动快，凝胶电泳时泳动的速度也较快。DNA拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶(topoisomerase)来实现的。图 2420 bp环形双股DNA，形成42匝螺旋。切开后旋松6圈后再连成环状，会形成两种构象结构。 超螺旋DNA可采取两种拓扑学上相当的形式。一种相当于双螺旋绕圆柱体旋转；另一种相当于双螺旋相互盘绕。超螺旋的这两种形式可以相互转变。图 3 DNA结构的上述变化可以用数学式来表述：L = T W L称为DNA

5、的连接数，它是DNA的一股链绕另一股链盘绕的次数，它代表环型双螺旋DNA分子的拓扑特性。在不发生链的断裂时, 它是一常数。例如，前图中DNA原来的L为42，放松后为36。在右手双螺旋中，L规定为正。T称为盘绕数，它代表DNA的一股链绕双螺旋轴所做的完整的旋转数。对B-DNA而言，它等于DN A的碱基数除以10（晶体中）。W为超盘绕数，代表双螺旋轴在空间的转动数，T和W是可变的。 前图中，其中原来的环型DNA的L=42，T=42，故W=0，即不存在超螺旋。它螺旋轴处在同一平面中，分子处于松弛状态。在保留一单链区的DNA分子中，L和T都为36，分子仍未形成超螺旋。在超螺旋DNA中，L仍为36，若使

6、T保持未松开前的42，W就成-6，即成为超盘绕 6次的负超螺旋。超螺旋是DNA三级结构的一种普遍形式。双螺旋DNA的松开导致形成负超螺旋，而DNA的拧紧则导致形成正超螺旋。 天然的DNA都呈负超螺旋，但在体外可得正超螺旋。溴乙锭、放线菌素D等的分子都是扁平的，它们可以嵌入DNA的碱基对之间。溴乙锭分子的嵌入能使相邻碱基对的间隔增至0.7 nm。对一个呈负超螺旋的环形 DNA分子来说，溴乙锭的嵌人并没有改变连接数，但盘绕数减少，结果超螺旋数向相反方向改变。随着溴乙锭量的增加，负超螺旋DNA就转变为松弛态；溴乙锭的再进一步增加，DNA就转变为正超螺旋。细菌质粒DNA的不同状态松弛型超螺旋部分解链G

7、yrase：促旋酶，旋转酶Topoisomerase：拓扑异构酶正螺旋和负螺旋DNA双螺旋为右旋螺旋。细胞中的环状DNA一般呈负超螺旋，即右旋螺旋不足导致部分碱基不形成配对，分子通过整体拓扑学上的右旋来补足右旋螺旋的不足，在数学上呈1：1，即分子整体右旋一圈来补双螺旋上的一圈不足。正超螺旋为双螺旋旋转过度，通过分子整体的左旋来解去过度的螺旋。正超螺旋 左旋负超螺旋 右旋为了说明超螺旋的方向，我们可以用一根细绳做实验，假设原来的绳子两股以右旋方向缠绕。如果在一端使绳子向紧缠的方向（overwinding）捻转，再将绳子两端连接起来，则会产生一个左旋的超螺旋以解除外加的捻转造成的胁变，这样的超螺旋

8、叫做正超螺旋。相反如果在绳子一端向松缠方向（underwinding）捻转，再将绳子两端连接起来，则会产生一个右旋的超螺旋以解除外加的捻转造成的胁变，这种超螺旋叫做负超螺旋。1）对于右手螺旋的DNA分子来说，当处于B-DNA构型时，一般每转一圈有10.5个核苷酸对，双螺旋处于能力学上最稳定状态，称为松弛（relaxed）状态（双螺旋轴没有“净弯曲缠绕”）。（2）如果每圈初级螺旋的碱基对数少于10.5，则其二级结构处于紧缠状态，由此而产生的超螺旋是正超螺旋。（3）如果每圈初级螺旋的碱基对数多于10.5，则其二级结构处于松缠状态，由此而产生的超螺旋是负超螺旋。 因此，超螺旋总是要向着抵消初级螺旋改

9、变的方向发展；双螺旋DNA的松开导致形成负超螺旋；而DNA的拧紧，则导致形成正超螺旋；所有的超螺旋都比松弛型含有更多的自由能。不同形状的DNA分子在琼脂糖中的迁移率松弛型，OC, Open circular DNA超螺旋, CCC, covalently-closed circular DNALinear DNA从细菌抽提得到的质粒DNA 样品中不含线状DNA大肠杆菌质粒DNA电泳方向线性化前线性化后真核生物的DNA不裸露平均每200bp的DNA绕核小体左旋1.75转，因此真核生物的DNA分子为正超螺旋超螺旋的生物学意义在活体中，DNA的结构不是一成不变的。DNA的各种构象是互变的，是动态的。

10、DNA的这种结构变化对它的功能具有重要意义。而DNA超螺旋程度的改变介导了这种结构变化。B-DNA是一种能热力学上稳定的结构，超螺旋的引入就提高了它的能量水平。负超螺旋的存在会影响DNA结构变化的平衡，具超螺旋的DNA能实现松弛态DNA所不能实现的结构转化。 大多数DNA的超螺旋密度约为-0.05，这相当于每200bp存在1负超螺旋。DNA的超螺旋水平在活体中是重要的，但它并不是在整个DNA分子中都是均匀的。DNA特定区域中超螺旋的增加有助于DNA的结构转化。DNA结构变化之一就是使DNA双股链分开，或局部熔解。超螺旋所具有的多余的能量被用于碱基间氢键的断裂。DNA中，10bp的分离大约需 5

11、0-209 kJ/mol，因此，DNA所具有超螺旋水平仅是分离很少几个碱基对，但DNA的这种结构上的变化对复制、转录等的启动仍很重要。核酸的分离纯化及测定分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。核酸的分离和纯化时应遵循两个原则： 保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。核酸的纯度要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。核酸分离纯化的注意事项 尽量简化操作步骤，

12、缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH410条件下进行； 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素； 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，

13、细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式的破裂及DNA样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA等。高温，如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为04以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。核酸分离纯化的一般步骤 破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质纯化干燥溶解。 核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，

14、可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl）。去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。DNA沉淀：0.3 M NaAC-70%乙醇。核酸的定量分析核酸的测定方法 紫外吸收法 在一定pH下测定样品的紫外吸光度（A260），即可由下式计算样品中的核酸含量： 其中：C为核酸的含量（mg/mL），Mr为相对分子质量，A260为核酸溶液的吸光度，为摩尔消光系数（即1升溶液中含1摩尔核酸的光吸收值），L为比色杯的内径（cm）C=MrA260/L紫外吸收法 1个A (1 OD2

15、60) 50g/ml 双链DNA 40g/ml RNA或单链DNA核酸纯度的测定 OD260OD280 纯DNA 比值1.8， 1.8 Pr、苯酚污染； 纯RNA 比值2.0， 2.0 DNA、 Pr、苯酚污染。核酸密度的测定 8 M CsCl，45000 rpm，16h 密度梯度：1.80 g/ml1.55 g/ml平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力=0 + 4.22（r2 - r02） 10-10 ：浮力密度 ：角速度（弧度/秒）r：样品到转轴的距离测定DNA的G-C含量G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系=0.1 xG-C + 1.658xG-C =（-1.658） 10定糖法

16、 RNA的测定：RNA分子中所含的核糖经浓硫酸或浓盐酸作用脱水生成糠醛，糠醛可与3，5-二羟甲苯（苔黑酚或地衣酚）反应生成绿色化合物，该化合物可在670-680 nm波长下进行比色测定。 DNA的测定：DNA分子中的脱氧核糖在冰醋酸或浓硫酸存在下可与二苯胺反应生成兰色化合物，该化合物可在595-620 nm波长下进行比色测定。定磷法RNA和DNA中都含有磷酸，可以进行磷的测定。纯的核酸中含磷量在9.5%左右，1 g磷相当于10.5 g核酸，测定核酸中磷的含量就可计算核酸的含量。测定时先将核酸用强酸将其中的磷消化成无机磷酸，后者与定磷试剂中的钼酸反应生成磷钼酸，在经过还原作用而生成蓝色的复合物-

17、钼蓝，最后在650-660 nm进行比色测定。核酸的凝胶电泳凝胶电泳是当前核酸研究中最常用的方法，有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者常用于DNA的分离分析，后者用于RNA及DNA的分离分析。DNA一级结构的分析 -测序（Sequencing）DNA核酸序列分析的简史上世纪60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。一方面，如何分离寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。1965，Cornall大学以S. W. Holley为首的科学家小组，首次完成了75个核苷酸的酵母Ala-tRNA的全序列测

18、定-即利用多种RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。引物延伸测序策略 1968年华裔生物化学家、生物学家吴瑞博士（Dr. Ray Wu） 独创性地设计出一种崭新的引物一延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了噬菌体两个COS末端的完整序列； 1977，F. Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定DNA序列的末端终止法； K. Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法； M. Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。核酸的序列测定-DNA酶法测序20世纪60年代，Holley首先测定了酵母Ala-tRNA的序列-

19、重叠法，非常繁琐。1975，Sanger采用加减法测定核酸序列，快速。1977，Sanger改进了测定方法-末端终止法，更加快速。现在有各种自动化核酸测序仪，核酸测序更方便快捷。The Sanger method is also known as dideoxy method DNA的一级结构的测定方法Sanger双脱氧(链终止)法(酶法测序） DNA的合成总是从5端向3端进行，合成需要模板和相应的引物链。DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3末端，依据碱基配对的原则，双脱氧底物通过生成新的3,5磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使

20、用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列。 每一种双脱氧核苷酸上可以连接上一个荧光标记分子，使得每一段被终止位置的寡核苷酸片段产生不同的荧光。所有标记的双脱氧核苷酸被加入同一根反应管，结果带不同荧光颜色的DNA片段用毛细管电泳按片段大小被分离，每个片段通过激光束给出一个单一峰，DNA序列通过峰的颜色被阅读。Maxam/Gilbert DN

21、A 化学降解法(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P)；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。化学裂解法测定DNA的核苷酸序列Maxam /Gilbert法DNA的变性与复性Denaturation and Renaturation of DNA-人类基因组中重复序列的发现 DNA双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还能解释DNA的重要特性-变性与复性，这对于深入了解DNA分子结构与功能的关系有重要意

22、义。 DNA变性 (Denaturation)1、DNA变性的概念：指DNA分子中的双螺旋结构解链为无规则线性结构的现象。2、DNA变性的本质：维持双螺旋稳定的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，不涉及到一级结构的改变。3、导致DNA变性的因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。DNA分子的变性 OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度增加 酸碱滴定曲线改变生物活性丧失RNA变性：从局部螺旋到线团之间的转变，RNA的变性引起的性质变化没有DNA的明显。变性后理化性质的变化DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核

23、酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融解相类似，又称融解温度(Tm, melting temperature)。在Tm时，核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的Tm值与其GC所占总碱基数的百分比成正相关。一般DNA Tm 值在85 - 90 C之间。增色效应(hyperchromic effect)：指DNA变性后其紫外吸收明显增强的效应。DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260 nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入螺旋内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫

24、外吸收，故而产生增色效应。完全变性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA 2540%、RNA 约1.1%实质：碱基暴露DNA的变性在紫外吸收上的变化1.37倍Hyperchromic effect 增色效应1 OD260 DS DNA 50 g SS DNA 37 g RNA 40 g不同来源DNA的变性曲线盐浓度对DNA变性的影响DNA分子的Tm与GC含量有关（1）DNA的均一性 （2）GC含量： 经验公式： XG+C（Tm69.3）2.44 或 Tm = 69.3+0.41(G +C)% （3）介质中的离子强度DNA的复性： 指经加热变性的DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋

25、结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性(renaturation)，此过程称之为退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成。DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因素的影响：1、温度和时间：比Tm 低20-25左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。2、DNA浓度：溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合的机会越大，有利于

26、复性。3、DNA顺序的复杂性：简单顺序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(U)这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。顺序复杂的序列要实现互补则困难得多。 DNA浓度与复性时间的关系T1/2 C constDNA复性与Cot分析复性过程，DNA的片段越大复性越慢，浓度越大复性越快。一定条件下用Cot来衡量复性的速度，Co为变性DNA的原始浓度，以核苷酸对摩尔浓度表示，t为时间，用秒表示。两种浓度相同但来源不同的DNA，复性时间长短与基因组的大小有关。具有重复序列的DNA，复性也快。Cot曲线的另一种表达形式人DNA的Cot曲线 哺乳动物的DNA 一般均呈左图的曲线，这是因为它们的基因组DNA 中插入了大量的重复序列，如人的DNA中就插入了长度为350bp的Alu序列