碱性磷酸酶值测定

1、关于碱性磷酸酶值测定第一张，PPT共十八页，创作于2022年6月实验目的学习环境因素对酶促反应速度的影响；学习米氏方程及Km值得测定；测量碱性磷酸酶km值；实验原理 E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等第二张，PPT共十八页，创作于2022年6月（一）米曼氏方程式中间产物 酶促反应模式中间产物学说E + S k1k2k3ESE + P相关E学原理第三张，PPT共十八页，创作于2022年6月1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。

2、S：底物浓度V：不同S时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximum velocity) m：米氏常数(Michaelis constant) VmaxS Km + S 第四张，PPT共十八页，创作于2022年6月当反应速度为最大反应速度一半时 Km值的推导KmS Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2Km + S Vmax VmaxSVmaxVSKmVmax/2 第五张，PPT共十八页，创作于2022年6月（二）Km与Vmax的意义 Km值 Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 意义：a) Km是酶的特征性常数之一；b) Km可近似表示

3、酶对底物的亲和力；c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。 第六张，PPT共十八页，创作于2022年6月 Vmax定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。第七张，PPT共十八页，创作于2022年6月（三）m值与max值的测定1. 双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法-1/Km 1/Vmax 1/S 1/V VmaxS Km+SV = （林贝氏方程） + 1/V=KmVmax 1/Vmax 1/S 两边同取倒数 第八张，PPT共十八页，创作于2022年6月2. Hanes作图法S S/V -Km

4、 Km/Vm 在林贝氏方程基础上，两边同乘SS/V=Km/Vmax + S/Vmax 第九张，PPT共十八页，创作于2022年6月酶浓度对反应速度的影响当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V = K3 E0 V E 当SE时，Vmax = k3 E 酶浓度对反应速度的影响 第十张，PPT共十八页，创作于2022年6月双重影响温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低 。 温度对反应速度的影响最适温度 (optimum temperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。* 低温的应用酶活性0.51.02.01.

5、50 10 20 30 40 50 60 温度 C 温度对淀粉酶活性的影响 第十一张，PPT共十八页，创作于2022年6月pH对反应速度的影响最适pH (optimum pH)：酶催化活性最大时的环境pH。0酶活性 pH pH对某些酶活性的影响 胃蛋白酶 淀粉酶 胆碱酯酶 246810第十二张，PPT共十八页，创作于2022年6月碱性磷酸酶km值的测定第十三张，PPT共十八页，创作于2022年6月操作试剂（ml）1234562.5mM磷酸苯二钠0.20.40.60.81.01.0蒸馏水0.80.60.40.2碱性缓冲液1.01.01.01.01.01.0混匀后，37水浴5min碱性磷酸酶0.1

6、0.10.10.10.1混匀后，37水浴15min(准确计时）酚试剂1.01.01.01.01.01.0碱性磷酸酶0.110%碳酸钠3.03.03.03.03.03.0混匀后，37水浴15min,以第6管调0与650nm比色，读取各管A值。第十四张，PPT共十八页，创作于2022年6月实验数据及结果管号A6501/A650s1/ s123456以上述数据双倒数作图，求出碱性磷酸酶的Km值。第十五张，PPT共十八页，创作于2022年6月实验讨论Km值的定义和意义是什么？米氏方程度表达式是什么，如何求出Vmax和Km？第十六张，PPT共十八页，创作于2022年6月现有某待测样品液5ml，将其稀释到100ml，取其稀释液1ml加入测定管按酚试剂法测其蛋白质含量，另取已知浓度的牛血清白蛋白溶液（250微克/ml）1ml加入标准管，其余操作同测定管。反应显色后测得吸光度分别为：A测