HLA测序技术在非亲缘性脐血移植应用价值探讨

1、HLA测序技能在非亲缘性脐血移植应用代价探究廖灿，杨昕，李焱，黄以宁，许遵鹏，吴洁莹，汤雪薇，陈劲松，吴韶清【摘要】1998年6月至2022年7月，广州脐血库向海内21家移植中央54例患者提供了非亲缘性异基因脐血。为了探究非亲缘性脐血移植供/受者HLA等位基因及其亚型与脐血移植GVHD产生率的干系，对54例非亲缘性脐血移植病例中，半年后有反响随访资料的48例，使用盐析或柱提法提取移植的非亲缘性脐血的DNA及移植病例的全血DNA，接纳HLA-SBT要领别离对HLA-A、B、DRB1位点举行了高区分分型，并与我库脐血网络通例接纳的HLA-SSPHLA-Sequeningspeifipriers低区

2、分效果举行了比力阐发。效果创造，HLA不合位点不多于2个和HLA不合位点不少于3个的病例GVHD的产生率具有统计学明显性差异P0.05。在对HLA-A、B、DRB1等位基因高区分单因素分型效果中，HLA-B和HLA-DRB1等位基因匹配全相合的病例GVHD产生率明显低于不完全相合病例GVHD的产生率P=0.000，P=0.005。结论：PR-SBT技能在非亲缘性脐血移植HLA配型方面具有紧张的临床应用代价。【关键词】非亲缘性脐血移植；HLA配型;HLA测序技能；HLA-SBT；脐血linialAppliatinfHLASequeninginUnrelatedUbilialrdBldTransp

3、lantatinKeyrdsunrelatedubilialrdbldtransplantatin;HLAisath;HLAsequening;HLAsequeningbasedtyping;ubilialrdbldHLA高区分分型技能不但可以对HLA血清学配型起到积极的校正作用，对研究哪些HLA等位基因相合可以显着削弱GVHD，哪些等位基因不相合可以耐受等方面以及订定相对个别化的HLA配型计谋都具有紧张的临床应用代价。在骨髓造血干细胞移植中，HLA测序分型技能得到了普及的应用和生长，在防范GVHD方面具有非常紧张的意义。本研究接纳以测序为底子的HLA分型技能HLA-sequeningbase

4、dtypingHLA-SBT对可随访的48例非亲缘性脐血移植病例HLA配型效果举行回首性阐发，以探究HLA-A/B/DRB1等位基因匹配程度对非亲缘性脐血移植GVHD的影响。质料和要领脐血泉源脐血样本全部来自广州脐血库，脐血分散、冷冻、保存以及相干检测参考相干文献2。移植供受体选择54例非亲缘性脐血移植供受者样本及随访资料由海内21家移植中央提供，此中6例待随访，选择48例非亲缘性脐血移植病例举行回首性阐发，移植受者一样平常环境见表1。Table1.Generalharateristisf48UBTreipients略急性移植抗宿主病aGVHD的防范48例移植病人均接纳环孢霉素+甲基强的松龙方

5、案防范aGVHD。移植供/受体的DNA提取移植供/受体DNA提取均接纳GTDNA提取试剂盒。HLA-SSP分型接纳neLabda公司的HLA-SSP分型试剂盒、PE9700PR仪举行分型，接纳neLabda公司提供的HLA分型格式表判读效果。HLA-SBT分型应用ABIPRIS3100型测序仪举行分型。DNA4l与PRixFrensi公司提供16l混淆，再参加金牌酶0.3l举行扩增反响。PR条件如下：9510分钟；9620秒，6030秒，723分钟，36个循环；4frever。取PR产物5l在2%琼脂糖凝胶中电泳，确定是否扩增。向PR产物中参加3lExSAP-IT,举行消化反响：3720分钟，

6、8015分钟。消化后产物与Sequeningix混淆后，举行测序反响：9620秒，602分钟，共25个循环。测序反响产物用NaA/EDTA去除多余的Sequeningix，并用100%及80%EtH沉淀和纯化DNA。参加15l甲酰胺，置于ABTPris3100测序仪中举行电泳。使用athTls及TNavigatr软件对电泳效果举行阐发，得出HLA高区分配型效果。统计学阐发数据用SPSS10.0统计软件包处置惩罚，行hi-squaretest阐发。效果PR-SBT技能分型48例非亲缘性脐血移植供受者HLA-A/B/DR接纳PR-SBT技能分型全部乐成，SBT分型效果在低区分程度HLA基因型星号后

7、2位数与SSP分型效果完全同等。48例非亲缘性脐血移植供受者中，HLA等位基因6/6相合4例8.3%，5/6相合37例77.1%，4/6相合7例14.6%；HLA等位基因亚型匹配5/6相合5例10.4%，4/6相合16例33.3%，3/6相合19例39.6%，2/6相合8例16.7%，未创造HLA等位基因亚型配型全相合病例。SBT分型效果与GVHD产生率48例非亲缘性脐血移植供/受者HLA等位基因分型效果中，HLA等位基因匹配6/6、5/6和4/6位点相合的移植受者GVHD别离产生4/4例、18/37例48.6%和5/7例71.4%，统计阐发hi-squaretest，HLA匹配程度与GVHD

8、产生率之间无统计学差异P0.05。48例非亲缘性脐血移植受者中，植入33例，HLA等位基因亚型匹配5/6相合的2例移植病例均未产生GVHD，而4/6、3/6、2/6位点相合的移植病例GVHD产生率别离为54.5%6/11、91.7%11/12和75.0%6/8，统计阐发hi-squaretest，HLA等位基因亚型不合位点不多于2个和HLA不合位点不少于3个的病例GVHD产生率具有统计学明显性差异P0.05。在HLA-A等位基因亚型分型效果中，HLA-A等位基因亚型匹配0/2、1/2和2/2相合病例别离为11、28和9例，GVHD产生率别离为27.3%3/11、57.1%16/28和55.6%

9、5/9，统计阐发未创造HLA-A等位基因亚型匹配完全相合与不完全相合GVHD产生率具有统计学明显差异P=0.061表2。Table2.RelatinshipbeteenHLAisathandurrenefGVHDin48UBTreifients略在HLA-B等位基因亚型分型效果中，HLA-B等位基因亚型匹配0/2、1/2和2/2位点相合病例别离为11、33、4例，GVHD产生率别离为72.7%8/11、45.5%15/33和50%2/4，统计阐发未创造HLA-B等位基因亚型匹配完全相合与不完全相合GVHD产生率具有统计学明显差异P=0.000表2。在HLA-DRB1等位基因亚型分型效果中，HL

10、A-DRB1等位基因亚型匹配0/2、1/2和2/2位点相合病例别离为16、25和7个，其GVHD产生率别离为25%4/16、64.0%16/25和71.4%5/7。统计阐发创造，HLA-DRB1等位基因亚型相合与否与GVHD产生率具有强相干性P=0.003表2。在38例HLA-DRB1等位基因全相合病例中，HLA-DRB1等位基因亚型匹配0/2、1/2和2/2位点相合病例别离为16、18和4个，GVHD产生率别离为25%4/16、61.1%11/18和50%2/4；经统计学阐发，比力HLA-DRB1等位基因亚型相合与不相合与GVHD产生率具有明显的统计学相干性P=0.008。与GVHD相干的H

11、LA等位基因亚型在本回首性研究中，HLA-A常见等位基因型为HLA-A*02、A*11和A*24，HLA-B常见等位基因型为HLA-B*15、B*40和B*46，HLA-DRB1常见等位基因型为HLA-DRB1*09、DRB1*12和DRB1*15表3。Table3.HLA-A/B/DRB1athingandurrenefGVHDbyPR-SBT略剔除两点不合的样本，选择受体与供体一个位点相合而另一位点不合的病例，比力其GVHD产生率。HLA-A*02、A*11和A*24基因型别离有19例、21例和13例；HLA-B*15、B*40和B*46基因型别离有20例、13例和14例；HLA-DRB1

12、*09、DRB1*12和DRB1*15基因型别离有11例、10例和13例表3。经统计阐发，HLA-A*11匹配与不匹配样本GVHD产生率别离为28.6%和64.3%，HLA-B各等位基因型匹配环境GVHD产生率未见显着差异，HLA-DRB1*12相合3例病例均未产生GVHD，而不相合的7例病例中有2例产生了GVHD。经统计阐发hi-squaretestsHLA-A/B/DRB1各个等位基因匹配程度与GVHD产生率未见统计学相干性。讨论有研究表白，单个等位基因的不匹配如碧眼儿HLA-A*0201和HLA-A*0205亚型可以引起严峻的GVHD；也有报道DRB1等位基因差异与GVHD之间存在强相干

13、性，并且DRB1不合与存活期收缩严密相干2。但是如今的研究表白，并不是全部等位基因差异与它的不相合是同等的，有些HLA等位基因的不相合是可以耐受的。在Nihlsn等3对HLA-DP抗原的报道中，接纳混淆淋巴细胞造就ixedlyphyteulture,L要领不雅察到最猛烈的LR反响与DPB1*0301和DPB1*0201有关，低LR与DPB1*0401和DPB1*0402有关。进步HLA基因分型的区分率，有助于探求HLA完全相合的造血干细胞供者，也有助于针对供、受间HLA差异程度订定相应的防治计谋。因此，有人提出界定供、受者HLA相合的尺度。寻出毕竟哪些HLA基因座位及其产物在决定异基因造血干细

14、胞移植预后中起关键作用，哪些HLA等位基因型别不相合为临床所容许，乃至大概对病例的预后有益9。本研究接纳HLA-SBT要领对48例非亲缘性脐血移植供/受体HLA等位基因亚型举行阐发，HLA低区分配型效果中，HLA等位基因匹配程度与GVHD产生率无明显统计学相干性。对HLA-A、B、DRB1等位基因亚型别离举行统计阐发创造，HLA-B和HLA-DRB1等位基因亚型完全相合和不相合的病例GVHD产生率具有非常明显的差异。必要特殊指出的是，在本研究效果中，HLA不相合等位基因亚型不多于2个和HLA不相合位点不少于3个的病例GVHD的产生率差异具有统计学明显性P0.05。以上效果从两方面给我们以提示：

15、HLA等位基因亚型程度的匹配对防范GVHD具有积极的作用；必然存在某些HLA等位基因亚型，其相合与否对脐血移植病例来说在某种程度上是可以耐受的。从效果中我们可以看到，在HLA高区分配型效果中，HLA-B和HLA-DRB1等位基因亚型匹配与否与GVHD产生率具有强相干性P=0.000，P=0.003。HLA-A等位基因亚型匹配全相合病例GVHD产生率27.3%显着低于HLA匹配不全相合病例(59.4%)。这说明在非亲缘性脐血移植中，接纳高区分要领举行HLA-B和HLA-DRB1配型可以显着削弱GVHD的产生率。由于样本数较少，因此对以上结论仍旧必要举行随访阐发。从本效果中可以推测，HLA等位基因

16、匹配与否对非亲缘性脐血移植者GVHD的产生具有紧张作用，脐血移植者GVHD的产生率低，究其缘故原由大概与脐血中免疫细胞的抗原性低有关。因此，非亲缘性脐血移植时对HLA接纳高区分分型是有需要的。本研究的另一个目的是试图探求出与GVHD产生严密相干的HLA等位基因型，但由于病例数较少，无法对HLA全部等位基因型在非亲缘性脐血移植的作用进一步深化阐发。我们选择了HLA-A/B/DRB1位点中比力常见的亚型举行统计阐发，从统计效果中我们未创造与GVHD具有显着相干性的等位基因型。在本研究效果中，HLA-A*11等位基因相合病例的GVHD产生率25%显着低于不相合病例的GVHD产生率58.3%，由于病例数少，无法进一步阐发HLA-A*11等位基因亚型对GVHD的影响。但我们可以假想，假设将来在移植前HLA复核时对HLA-A11接纳HLA高区分要领，大概会低落移植后G