STRPCR半定量检测嵌合体方法在非清髓异基因造血干细胞移植中的

1、STR-PCR半定量检测嵌合体要领在非清髓异基因造血干细胞移植中的【摘要】目的应用STR-PR半定量嵌合体检测要领监测非清髓异基因造血干细胞移植nn-yelablativeallgenEisteelltansplantatin，NAST后嵌合体。要领接纳短串联重复序列-聚合酶链反响STR-PR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色以及凝胶成像阐发技能对28例担当NAST的患者举行嵌合体监测。效果27例患者形成造血细胞嵌合体，完全嵌合pletehieris，22例，混淆嵌合ixedhieris，5例；此中低比例嵌合llevelfixedhieris，L3例，高比例嵌合highlevelfixedhier

2、is，H2例。不变植入的患者+7天即达H，3例患者复发前检测到供体细胞嵌合率dnrell，D落落，1例在状态下复发，1例L产生早期移植排挤，恒久存活者均保持不变。嵌合体监测下早期担当临床干预治疗的患者转化为并延伸了无病保存期。结论STR-PR是一种简朴、敏感、经济的监测非清髓移植后嵌合体的要领。熊辉霞1977，女，汉族，青海籍，主治医师，硕士【关键词】短串联重复序列非清髓造血干细胞移植造血嵌合体KeyrdsshrttanderepeatsNn-yelablativesteelltransplantatinNeatpietihieris非清髓异基因造血干细胞移植NAST由于减量的放、化疗预处置惩

3、罚加上强效的免疫按捺，移植后多形成供、受体细胞差异比例的混淆嵌合体，并呈动态变革1,2。嵌合体监测对阐发植入状态，断定疾病复发及引导移植后续治疗具有紧张意义。短串联重复序列STR是如今检测嵌合体最常用的遗传标识表记标帜，我们接纳STR-PR半定量要领对28例担当NAST的患者举行了嵌合体的检测，现陈诉如下。1资料与要领1.1病例资料不雅察工具为2022年至2022年在东南大学隶属中大病院血液科担当NAST的患者28例，男19例，女9例，年事15岁58岁，中位年事37岁。此中慢性粒细胞白血病L19例，慢性淋巴细胞白血病(LL)1例，急性非淋巴细胞白血病(AL)3例，骨髓增生非常综合征(DS)4例

4、，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)1例。同胞供者24例，无血缘干系供者2例,HLA配型均为全相合；单倍型亲缘供者2例，均为DR位点不合。供、受者性别相合18例，性别不合10例。AB血型相合21例，血型不合7例。1.2要领术前网罗供者和受者外周血2l，术后+7天、+14天、+21天、+30天网罗患者外周血，今后据患者随访时间网罗外周血每月1次或每3月1次。行供体淋巴细胞输注dnrlyphyteinfusin，DLI治疗后每15天网罗受者外周血1次，直至可评价的尽头。移植后早期造血按捺期每次抽血5l，今后每次2l，AD抗凝，于采血后24h内用红细胞裂解液裂解红细胞，提取白细胞，用helex-100法快速

5、提取基因组DNA，编号后置-20冰箱保存。本研究选择STR位点的原那么是：均为四碱基重复序列错配较少；杂合度较高有较高的个别识别本领；等位基因个数适中，均匀610个易于分型；等位基因频率在研究人群所属地域漫衍较好。按文献3,4选择D5S818、D13S317、D3S1358、D8S1179、D7S820、D16S539、FGA、vA8个位点举行检测。先对供、受者术前标本在上述8个位点举行扩增，对扩增产物行非一连非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色显影，按照等位基因途径Ladder比较阅读列位点的基因型,寻出各组供、受体可区分互相的有信息位点，按Thiede等5陈诉的要领举行分类，选择出类和类位

6、点，术后标本仅在类和类位点扩增，凝胶用UVP成像阐发体系举行灰度扫描后用Gel-Pr4.0软件阐发，选择相应的公式以整合光密度ID值盘算供体细胞嵌合率D。完全嵌合体：D95%；混淆嵌合体：5%D95%；高比例嵌合体H：D50%；低比例嵌合体L：D50%。2效果移植1个月后，28例患者中仅1例DS-RA患者未检测到嵌合体，造血始终未规复，AN0.1109/L，骨髓增生非常减低，证实移植失败，于移植后45天死于严峻熏染。余27例患者均形成差异比例的供、受者造血细胞嵌合体，此中22例形成；5例形成；2例形成高比例混淆嵌合H；3例低比例混淆嵌合L。全部不变植入的患者在+7天时的均匀嵌合率是74.71%

7、，此时尚处于造血按捺期，+14天多数病例达，均匀嵌合率是95.74%。移植后随访1.5月27月，均匀11个月，22例患者中3例患者复发前检测到D落落，1例在状态下复发，恒久存活者均保持不变。5例患者中，1例L的LL患者早期出现移植排挤，+1月时STR-PR查抄仅在vA、D7S820、D5S818位点检测到少量的供者型遗传标识表记标帜D为27%，但血通例查抄提示造血规复，思量为早期移植排挤，自身造血规复，经2次DLI后渐渐到达，并保持不变见图1；另2例L患者早期复发，1例殒命，1例经二次尺度移植后得到。2例H患者中的1例为L，移植后1月即为D为54%，实时予DLI1次，DLI后+1.5月时已有治

8、疗反响，D上升到80%，出院后患者未能继承监测嵌合体，+4月时出现遗传学复发Ph阳性染色体占90%，再次入院，予DLI1次，疗效不佳，敏捷出现血液学复发，嵌合体检测为完全受者型见图2。另1例H患者+1月后举行性落落，脾肿大，骨髓增生显着活泼，诊断为脾成效亢进，STR-PR查抄一连，DLI后未见D上升，+4月时行脾切除治疗，+8月时转为，并保持不变。3讨论STR是一类呈高度多态性的遗传标识表记标帜，STR-PR技能敏捷、快速，是如今最常用的检测嵌合体的要领之一7。国表里有多家移植单元接纳荧光标识表记标帜的多重PR结合DNA测序仪和基因扫描软件步伐检测嵌合体，固然具有主动化程度高、无交织污染、省时

9、快速等长处，但由于多个位点在同一反响管内扩增，其敏感性阈值较单一位点STR-PR要领的敏感性低，而且对仪器装备要求高，恒久监测用度昂贵，海内难以普及。我们接纳STR-PR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色以及凝胶成像阐发技能检测嵌合体的要领，起首挑选出能区别供、受体的有信息的位点，并进一步寻出敏感性较高的阐发位点，在移植后嵌合体的恒久监测中，我们只需选择对供受者得当的少数位点举行检测即可反响充足的临床信息，而且不需特别的试剂仪器，轻便易行。同时我们还创造，微卫星位点的选择非常紧张，并非全部的信息位点都得当于嵌合体的定量检测，有些位点在定性阐发时成心义，但在定量阐发时意义有限。嵌合体检测的目的重要是

10、在以供者细胞为条件的条件下创造受者细胞，影响定量阐发效果的一个紧张因素是等位基因的长度。由于PR时存在以下两种征象影响扩增服从的同等性：1短片断优先扩增；2平台效应。因此，在选择阐发位点时，应满意受者等位基因长度小于供者等位基因长度。同时我们进一步创造，假设目的基因是纯合子，那么检测的敏感性更高。但在现实应用中，假设患者和供者的血缘干系非常近，有大概寻不到切合上述条件的STR位点，就不得不选择一些敏感性较次的位点。我们的研究创造植入乐成的患者在+14天多数达，在之后的随访中，凡恒久存活的病例都能保持不变，5例均不不变，有D进一步落落导致移植排挤和复发的倾向。此效果提示早期供体植入率是影响NAST可否产生移植排挤的紧张因素，+100天内更应增强嵌合体监测并实时接纳防范方法。STR-PR技能可在严峻粒细胞缺乏阶段实行，嵌合体检测固然不克不及直接检测出残留的白血病细胞，但由于受体细胞比例增长与移植排挤和复发的伤害性高度相干8,9，因此可通过定量检测供体细胞嵌合率，来断定患者体内残留的受体细胞程度。DLI是移植后临床干预治疗的紧张构成部门，其诱导的移植物抗白血病效应graftversusleukeiaeffet，GVL在肿瘤细胞负荷低时易发挥根治性作用，掌握DLI的机