强力霉素对移植肺缺血再灌注损伤中细胞凋亡的研究

1、强力霉素对移植肺缺血-再灌注损伤中细胞凋亡的研究【摘要】目的讨论外源性基质金属蛋白酶(atrixetallprtEinases，Ps)抑制剂强力霉素在移植肺缺血-再灌注损伤中细胞凋亡的影响。方法建立大鼠自体左肺肺缺血再灌注模型，16只SD受体大鼠随机分为两组:缺血再灌注组和强力霉素组，用免疫组化方法观察移植肺Bl-2、Bax和aspase-3表达情况，并取肺组织平滑肌细胞进展培养，采用荧光技术测定肺组织细胞凋亡。结果肺缺血再灌注后，与对照组相比，强力霉素组移植肺Bax和aspase-3表达明显降低(P0.01)，Bl-2的表达无明显变化(P0.05)，但Bl-2/Bax比例升高；荧光图片显示，

2、强力霉素组的细胞凋亡明显较对照组减少。结论强力霉素可能通过下调Bax、aspase-3表达，进步Bl-2/Bax比例而抑制肺缺血再灌注损伤的细胞凋亡，并通过降低基底膜的降解，减轻肺水肿，到达bliterativebrnhitis，B发生率相关。因此，研究低温肺保存后再灌注损伤的机制，改善移植肺功能，仍然是肺移植领域中所急需解决的重点课题之一。众多研究说明，体重250340g，随机分为两组：A组n=8：缺血IR组，大鼠左肺经历原位热缺血30in、冷缺血3h、热缺血30in和不同时间的再灌注处理；B组n=80.5g/kg，30g/L的戊巴比妥钠30g/kg腹腔内注射，麻醉成功后，将大鼠右侧斜位固定

3、于手术台上。气管切开插管连接微型动物呼吸机。辅助呼吸参数为：潮气量10l/kg，呼吸频率75次/in，吸入氧浓度Fi21.0，呼气末正压2.0H2。右侧颈动脉插管，用于采集标本、监测血压；右侧颈静脉穿刺备用；尾静脉微量注射泵持续补液，速度为4.0l/(kgh)。经左第5肋间前外侧切口进胸并横断胸骨，翻开纵隔。颈静脉注射肝素钠375.U/kg后，剥离左肺门，离断左下肺韧带；经左向右游离右肺动脉、静脉及主支气管，预置阻断带。然后用一塑料袋内径约2.5套住左全肺，并在肺门处形成反折，连同塑料袋一起用无创伤钳于吸气末阻断左肺门根部1，2，此时潮气量减至8.0l/kg，呼吸频率100次/in，其他参数不

4、变。30in后，在反折的塑料袋参加冷生理盐水及小冰块，把套有塑料袋的左肺上提至切口平面勿与周围脏器接触。袋内置一温度计使之保持在4左右。冷缺血3h后去除冷盐水，使左肺又转变为热缺血;30in后松开无创伤钳，形成再灌注。同时颈静脉给予鱼精蛋白2.43.0g/kg。待血压、呼吸稳定后肉眼上，左肺变得红润，约需10inPVEs的培养与鉴定结合应用盐酸氯氨酮(20g/kg)和安定(2g/kg)麻醉，开胸在左心室剪一小口，从右心室注入20lD-Hanks液(在1L去离子水中参加参加12滴胎牛血清，接种到T25的培养瓶中，372孵箱中放置30in，参加或参考空间，将上述检测分子的阳性面积除以包容空间，取其

5、均值%作为“阳性区域面积参加20l的0.5g/lHehst33258储存液，室温放置10in，荧光显微镜观察凋亡细胞并拍片。1.3统计学分析所有数据均以均数标准差(xs)表示，两组间比拟采用t检验。统计学处理由SPSS11.0统计软件完成。P0.05为有统计学意义。2结果2.1Bl-2、Bax、aspase-3蛋白程度变化与对照组相比，强力霉素组Bax和aspase-3表达明显降低(P0.01)，Bl-2表达无明显增高(P0.05)表1。表1各组Bl-2、Bax和aspase-3的表达%(xs，n=8)那么整齐，染色质均匀分布(图1)，对照组的PVEs细胞核那么出现不均匀亮度的蓝色荧光，细胞核

6、先后呈现凋亡早期(波纹状)、中期(核染色质凝聚，边缘化)和晚期(核裂解，产生凋亡小体)的典型变化，其凋亡的细胞主要是肺泡上皮细胞及内皮细胞(图2)。3讨论缺血再灌注损伤是肺移植后早期出现原发性移植物功能不全priarygraftfailure，PGF的主要原因，临床主要表现为进展性的低氧血症，肺顺应性降低，毛细血管通透性增加导致肺水肿，在X线胸片上表现为广泛的肺泡密度增高影2。此外，IR可引发早期的排挤反响，并与移植后晚期较高的闭塞性支气管炎B发生率相关4。因此开展移植肺IR损伤的研究对肺移植的成败显得尤为重要。凋亡是以DNA发生特异性的片段化断裂，形态上表现为核固缩、胞膜内陷、皱缩、包裹胞质

7、形成凋亡小体为特征，受特定的基因调控。Fisher及Staberger等都曾提出凋亡为肺缺血再灌注损伤的早期事件5，6。虽然肺缺血再灌注损伤时产生的自由基、细胞因子等是促进细胞凋亡的诱导因素，但这些因素并不直接引起细胞凋亡，而是通过一定的信号传递方式激活生存与死亡的相关基因(如Bl-2、Bax、p53等)，然后将信号传递到核内切酶，激活aspase-3执行死亡功能。其中Bl-2和Bax是两个重要的相关基因，前者抑制细胞凋亡，而后者促进细胞凋亡，并且Bl-2和Bax蛋白表达的比例是决定细胞凋亡与否的关键7。本实验也证明，再灌注后肺组织细胞凋亡明显增加，参与肺损伤作用。强力霉素能抑制在体肺缺血再灌

8、注损伤中血管内皮细胞Bax和aspase-3表达，对Bl-2的表达无明显影响，但Bl-2/Bax的比例明显进步，从而发挥抗肺血管内皮细胞凋亡的作用。缺血-再灌注的损伤机制虽很复杂，但微血管完好性被破坏是其损伤的中心环节8。血管基底膜是控制微血管通透性的最重要的构造。外源性基质金属蛋白酶atrixetallprtEinases，Ps是一类以Zn2+为辅助因子的蛋白酶家族，其中P-2和P-9能降解肺毛细血管基底膜的基质成分，与微血管完好性亲密相关9。生理条件下，大鼠肺组织能表达低程度的prP-2及活性P-2、prP-9，几乎不表达活性P-910。缺血、缺氧条件下可以诱发内皮细胞、血管平滑肌细胞等分泌Ps；同时缺血-再灌注诱发炎症反响，此时，炎性细胞成为Ps的重要来源。强力霉素是四环素类抗生素的一种，大量研究显示四环素类及它们经化学改进、非抗生素类似物是一类广谱的P抑制剂。其参与肺缺血再灌注损伤的可能机制表如今以下几个方面11：(1)抑制肺血管内皮细胞的凋亡；(2)通过去除其他细胞产生的反响性氯化物阻止P酶原的激活；(3)抑制其他