临床基因扩增检测质量保证（180503山东PCR培训班）

1、2018-5-14? 什么叫质量保证?与质量控制有何区别 ? 分析前质量控制的关键点 ?临床基因扩增检测质量保证 PCR实验室如何分区 ?要分几个区?要否缓冲间? “无基因”及“无核酸”概念? 质量管理的“灵魂” ? 试剂方法的性能验证如何做 ? 自配试剂自建方法 可以吗?李金明 国家卫生计生委临床检验中心Telmail: 基因突变和基因多态性检测如何进行室内质控?2018.05.03. 山东基因扩增培训班?质量管理的“精髓” 分子诊断的报告 ?涉及临床医生标本采集环节和实验室质量保证的关键点检验申请单；标本采集、运送和保存（分析前）质量保证 (Quality 检验

2、申请单是合适的：对 “Who”在“When”开出“What”申请单Assurance,QA) ：为一产品或服务满足特定质量要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施 标本是正确的和好的： 采集、运送和保存涉标 及本 临采 床集 医环 生节和实验室 实验室环境条件是好的： 温湿度、可能的干扰的避免（分区、灰尘、电磁、振动等）检标测本申采请集单、运送和保存（分析前）结果报告解释及临床应室内质控（分析中） 仪器设备状态是好的： 维护、定期校准质量保证用（分析后） 试剂是好的：性能验证或性能确认、批质检 实验室人员是有能力的： 外部和内部培训，能力评估结释 果及 报临 告床 解应室内质控（分析中）

3、质量保证用（分析后）涉及实验室人员和临床医生 SOP的可操作性及全员遵循涉及实验室 得到结果的过程是有监控的： 室内质量控制和室间质量评价（或实验室间比对）涉及实验室人员和临床医生涉及实验室质量控制 针对差错、投诉、失控等分析原因采取措施的质量持续改进室（间分析质评中）室间质评 临床医生能正确的理解和应用检验结果于患者疾病的诊断和治疗涉及实验室（分析中）涉及实验室我国对临床分子诊断实验室的质量管理的发展我国个体化医学检测质量管理和标准化前期工作 卫生部临床检验中心成立，其后各省市临床检验中心相继成立 临床实验室总体上的经验管理时 间内容1982年2002年2005年2006年-2010年 室内

4、质量控制和室间质量评价2012.10.25检验分会、卫生部临检中心召集（成都）： 个体化医学检测质量保障策略专家研讨会卫生部医政司召集（长沙）： 个体化医学检测质量保障策略提请工程院项目论证中国工程院项目论证： 个体化医学检测所涉及的技术、方法、应用及规范化管理论证会卫办医政函2013195：卫生部办公厅下发关于开展个体化医学检测规范化管理工作函 临床基因扩增检验实验室管理暂行办法 （卫医发200210 号）2013.01.072013.01.302013.03.11ISO15189 认可(ISO 15189:2007. Medical laboratoriesparticularrequir

5、ements for quality and competence . Geneva: International Organizationfor Standardization, 2007. 医疗机构临床实验室管理办法 卫医发200673 号）2013.05.132013.07.24专家委员会首次会议（北京）： 明确职责、制定计划专家委员会第二次会议（北京）： 起草管理办法和相关技术指南的框架和大纲 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法 （卫办医政发2010194 号）2013.11.182014.08.19专家委员会第三次会议（沈阳）：审阅 起草的管理办法和相关技术指南初稿专家委员会第四

6、次会议（大连）： 管理办法和相关技术指南定稿会12018-5-14个体化医学检测管理办法及相关指南和导则的制订分工指南名称负责人药物代谢与效应基因多态性检测相关技术指南肿瘤相关的个体化医学检测技术指南周宏灏院士詹启敏院士曾益新院士曾溢滔院士尚 红教授程 京院士于 军教授陈 杰教授程 京院士尚 红教授李金明教授分析前遗传病相关个体化医学检测技术指南病原微生物相关的个体化医学检测技术指南芯片技术的个体化医学检测应用技术指南测序技术的个体化医学检测应用技术指南原位杂交技术的个体化医学检测应用技术指南个体化医学检测LDT的相关技术指南个体化医学检测实验室管理办法?检验申请单和标本采集、运送和保存中的关

7、键点Who:临床表现异常患者 （代谢性疾病、基因病 )、产前筛查（染色体 对“Who”在“When”开出“What”申请单非整倍体、遗传病）、 肿瘤患者（靶向治疗、预后 、转移监测）、正常人（风险预测？甚或健康体检? ）、 容器：密闭的、一次性、无菌、无核酸酶及其他扩增抑制物 采集方法：人（训练有素）、防污染、处理When： ? 运送保存时间和温度：尽可能快 ?低温? 合格标本:容器完整、量够、时间符合要求、外观符合要求、处理符合要求What: 采用什么样的样本?使用什么样的方法?检测哪些基因改变?疾病风险预测?疾病风险预测? （案例）22018-5-14对 “Who”在“When”开出“Wh

8、at” 申请单ASCO（2003年修改，2010年重申）关于Genetic andGenomic Testing for Cancer Susceptibility 的声明，肿瘤易感性遗传检测只能在以下情况下进行：（1）有遗传性肿瘤易感性的个人或家族史；（2）检测结果可得到充分的解释；以染色体非整倍体NIPS为例（3）结果有助于患者或有肿瘤风险的家族成员的 诊断，或影响其临床治疗或手术。案例：染色体非整倍体高通量测序（ NIPS）对“Who”在“When”开出“What”申请单案例: 某医院开展了染色体非整倍体的 NIPS高通量测序检测，孕妇检测结果为 T21阳性，医生及孕妇（含家属）找到实验

9、室， 说孕妇已怀孕32周，如果进行产前诊断（羊水检查），等结果出来，如果是真的T21，就不能引产；如果根据现在结果引产，引下来，不是T21又怎么办?开展孕妇外周血胎儿游离 DNA实验室检测的医疗机构（以下简称检测机构）应当具备临床基因扩增检验实验室资质，严格遵守 医疗机构临床实验室管理办法 、医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法 等相关规定，相应检验项目应当接受国家卫生计生委临床检验中心组织的室间质量评价。从事孕妇外周血胎儿游离 DNA产前检测的实验室人员应当经过省级以上卫生计生行政部门组织的临床基因扩增检验技术培训，并获得培训合格证书。Who用于NIPS的外周血cffDNA特点适用人群（一

10、）血清学筛查显示胎儿常见染色体非整倍体风险值 介于高风险切割值与 1/1000之间的孕妇。（二）有介入性产前诊断禁忌证者 （如先兆流产、发热、出血倾向、慢性病原体感染活动期、孕妇 Rh阴性血型等）。（三）孕20+6周以上，错过血清学筛查最佳时间 ，但要求评估21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征风险者。 母体血浆中cffDNA含量占总游离DNA的大约510，长约150bp，怀孕4周即能检出，其在血液中的半衰期只有 16min，出现2小时后即不能测出。慎用人群有下列情形的孕妇进行检测时，检测准确性有一定程度下降，检出效果尚不明确；或按有关规定应建议其进行产前诊断的情形。包括：（一）早、中

11、孕期产前筛查高风险。（二）预产期年龄 35岁。（三）重度肥胖（体重指数 40）。（四）通过体外受精 胚胎移植方式受孕。（五）有染色体异常胎儿分娩史，但除外夫妇染色体异常的情形。（六）双胎及多胎妊娠。 cffDNA在母体循环中较稳定，可能与来源于胎盘的微粒能够保护他们免受核酸酶降解相关。（七）医师认为可能影响结果准确性的其他情形。When：12+022+6周What：NIPS不适用人群有下列情形的孕妇进行检测时，可能严重影响结果准确性。包括：（一）孕周10次/小时）符合“各区独立”吗?外走廊门门产物分析区扩增区标本制备区 试剂准备区空气流向缓冲间空气流向缓冲间空气流向缓冲间空气流向缓冲间扩增及产

12、物分析区B标本制备区门试剂准备区门专用走廊工作流向门外走廊门因地制宜标本制备区因地制宜空气流向+门扩 增 及 产物分析区扩增和产物分析区试剂准备区空气流向试剂准备区其他实验室其他实验室其他实验室空气流向+空气流向空气流向门门门走廊走廊标本制备区空气流向扩 增 及 产物分析区其他实验室空气流向其他实验室其他实验室其他实验室空气流向试剂准备区空气流向标本制备区门62018-5-14方便工作?关于传递窗产物分析区扩增区空气流向标本制备区试剂准备区传递窗传递窗传递窗空气流向空气流向缓冲间空气流向专用走廊缓冲间缓冲间工作流向关于“分区”、缓冲间和生物安全柜“无基因”或“无核酸”概念的重要性！产物分析区扩

13、增区标本制备区试剂准备区“各区独立注意风向空气流向空气流向空气流向空气流向因地制宜缓冲间缓冲间缓冲间方便工作”专用走廊工作流向实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台和工作量来决定分区的多少及各区域的空间大小。至少具体需要多少个区，同样是 “个体化”的，以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时“作为基本原则。缓冲间的功能是“控制空气的流向”。Lab-on-a-Chip生物安全柜可考虑“A2”。各区通风换气（10次/小时）尊敬的李教授：您好！刘大夫：来信请教一个问题，具体情况是这样的：我这儿使用的PCR仪是ABI 7300，用的是达安公司的HBV-DNA试剂，去年12月中旬的一次试验中

14、发生了爆管事件，事件发生后，已经按照SOP规程进行了消毒处理，到现在已经有 半年了，可还是不能消除污染。PCR实验室在三楼，现在即使加样操作放在同一幢楼房的 一楼进行，其余如混匀、温育、离心等还放在原来的实验室，扩增也在原来的实验室，阴性对照孔所加对照都未如标本一样处理（因此暴露在空气中的时间很短），可是 阴性对照孔仍有扩增，大约在21个循环的时候开始，阴性对照显示的Ct约为26左右。请问这是什么原因，怎么处理才能消除污染。盼指点！PCR实验室一旦出现严重污染，消除将会比较困难，通常可采用下述方法：（ 1）开窗通风;（2）采用次氯酸钠溶液擦地面及实验台面，甚至墙面;（3）增长紫外照射时间；（4

15、）用75%乙醇空中喷雾，然后用于次氯酸钠溶液擦地面及实验台面。上述措施每天都要进行，直至污染消除。不知你是否按上述方法进行？如没有，你可以这样试，并请将效果告诉我。尊敬的李教授：李教授：您好！我是上次向您请教PCR实验室污染如您好！您所说的措施我都实行过，只不过除通风外，其余措施仅实施过很少几次 ，我将按您所说措施处理一段时间再看看。另外，再请教两个问题：（1）上述措施要在三个区都进行吗？（2）楼房第三层污染，在第一层操作怎么也会受到影响 ？何清除的小刘，我们按照您的指点进行处理，现在实验室污染已经完全清除 ，非常感谢！以后我们会更加注意操作的规范及相关知识的学习！此外，在实验室出现严重污染后

16、，如还要进行工作，则可临时更换一个厂家试剂，应就可以。谢谢您拨冗指教！20130508刘X2013.7.1820130508刘X20130508 72018-5-14尊敬的李教授：您好！我是XX市XXXX医院的检验科的孔XX，来信请教您一个问题，具体情况是这样的：我们这里使用的PCR仪是上海宏石的SLAN ，试剂是湖南圣湘的HBV DNA试剂，11月初在做实验的时候发现阴性对照孔有扩增，排除试剂污染及人为偶然因素后，阴性对照孔仍有扩增，在实验时，我们放置在1室、2室空气暴露的PCR反应管，用蒸馏水当样本检验，大约23个循环的时候开始扩增，阴性对照显示的Ct值约为27，可能是由于不同区域的拖把混

17、用 导致的实验室污染，现在我们每天都用实例：因突变检测出现实验室“污染”EGFR基2000mg/L的有效氯消毒，擦拭台面、地面，甚至墙面， 75%的酒精擦拭移液器，生物安全柜等，到目前为止，污染仍不能去除 。请问怎么处理才能快速的消除污染，盼指点！孔XXXX 市XXXX医院的检验科2016.11.28The Scientist82018-5-142011年9月29日Mikovits 被惠特莫尔彼得森神经免疫疾病研究所（ WhittemorePeterson Institute for Neuro-Immune Disease ，WPI）从研究主任的位置上 开除。2011年11月4日，WPI指控

18、Mikovits 在被开除后，非法消除实验笔记 ，并且将其它有关研究工作信息保存在私人笔记本电脑 、闪存盘和e-mail账户中。而WPI则获得了临时禁止命令，禁止 Mikovits 破坏，删除和改动 ”任何相关的文档或数据。Mikovit代理律师则对指控极力否认。Mikovits 由于重罪指控而被捕，且不能被保释。92018-5-14实验室仪器设备及管理加样器：维护、校准扩增仪：维护、校准测序仪：维护、校准发光光度计：维护、校准电泳仪：维护恒温干浴仪或水浴箱 ：维护、校准离心机：维护案例：加样器由计量部门校准生物安全柜：维护冰箱：维护案例：扩增仪等由厂家校准，但无任何校准实验记录，亦校准SOP

19、ABI7500校准报告ABI7500校准报告ABI7500校准报告102018-5-14基因扩增仪器设备的质控仪器设备质控方法频 度失控标准扩增仪仪器校验实验当仪器移动时实验失败热电偶监测温度扩增功能检测每月一次每4个月一次如靶温度或温度差异超出允许范围待测孔未出现扩增，检测温度程序打印校准每次测定时每年2次打印程序不对不符合要求不符合要求加样器水浴箱温度检测每次实验112018-5-14试剂方法的性能验证（ verification）性能指标：临床实验室在性能验证上最大的问题是什么 ?不愿意“动”（脑和手） ?重复性（精密度）（ 定性和定量）准确性（定量：回收率、标准物质等；定性： 方法学比

20、较等）线性范围（定量）不知道如何 “动”? （概念不清、方法不清）到底要做哪些指标的性能验证?怎么做?分析特异性（定性和定量）测定下限或分析敏感性（ 定性和定量）抗干扰能力（定性和定量）“性能验证”（“verification ”）定义 “verification ”： broadly as “confirmation through the provision of objectiveevidence, that specified requirements have been fulfilled ” . （广义为通过提供客观证据证明特定的要求得到满足 ）肿瘤组织标本的EGFR检测 CLIA

21、 uses the term “verification ”： specifically to relate to confirmation that thelaboratory using a test can replicate the manufacturer s performance claims whenthe test is used according to the package insert. （CLIA性能验证术语特指使用某特定检测试剂或系统的实验室 按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能。）122018-5-14分析敏感性（质粒）分析敏

22、感性使用质粒混合物材料和方法结果：表3分析敏感性（检测下限）（使用质粒样本）分析敏感性（蜡埋样本）中文简译使用FFPET样本混合物样本：6个最常见突变的质粒，与野生的细胞系 DNA混合成含5%突变的浓度，再对5%突变的样本进行系列稀释。材料和方法样本稀释液：野生的细胞系DNA方法：对每种含5%突变的上述样本用稀释液稀释成 6个独立的系列，每一稀释浓度24个样本， 每个系列使用3个不同比试剂检测，每批试剂进行 24个重复检测，每一浓度样本得到72个结果结果如表4LOD计算：有95%检出的最低突变浓度即为检测下限 （表3）。结论分析敏感性（检测下限） （使用FFPET样本）分析敏感性验证方案如何写

23、（使用FFPET样本） ?中文简译样本：EGFR Exon19del 和L858R突变各2个FFPET标本，分别用EGFR野生型FFPET提取的DNA系列稀释成含10%、5.0%、2.5%和1.25%突变的样本，突变比例可采用ddPCR或NGS验证。样本：EGFR Exon19del 和L858R突变各3个FFPET标本，分别用EGFR野生型FFPET提取的DNA系列稀释成含10%、5.0%、2.5%和1.25%突变的样本，突变比例采用高通量测序（454）验证。样本稀释液：野生的细胞系DNA样本稀释液：野生的细胞系DNA方法：每个系列使用2个不同批试剂检测，每批试剂进行 4个重复检测，每一浓度

24、样本得到8个结果方法：每个系列使用3个不同批试剂检测，每批试剂进行 8个重复检测，每一浓度样本得到24个结果LOD计算：有95%检出的最低突变浓度即为检测下限。LOD计算：有95%检出的最低突变浓度即为检测下限 （表4）。会写基因突变分析敏感性验证的SOP或验证方案了吗？132018-5-14准确度（与参考方法测序比较）测定范围与Sanger测序比较分析特异性、抗干扰能力、重复性重复性交叉反应性中文简译肺相关微生物或分析特异性样本：6个FFPE样本，包括2个野生型样本，4个突变样本（分别为Exon19del 、S786I、G719X和Exon20插入突变）干扰物稳定性或样本处理的重复性方法：由

25、2个操作者，对上述样本用 2批试剂，两台Cobas Z480 分析仪，4天内双管重复检测，正确检测率为 98%（188/192）重复性会写基因突变检测重复性验证的SOP或验证方案了吗?重复性验证方案如何写 ?检测性能验证至少要验证哪些指标 ?重复性（精密度）、 检测限（分析敏感性）、 检测样本：3个FFPE样本，包括1个野生型样本，2个突变样本（分别为Exon19del 和Exon20插入突变）范围（最主要突变位点）、ctDNA 线性范围方法：由2个操作者，对上述样本用 1批试剂，1台Cobas Z480 分析仪，4天内双管重复检测，观察正确检测率 是否能达到98%如果使用的是国产试剂盒，性能

26、指标不清晰，如何验证?参考上述国外试剂盒说明书编与 SOP进行验证142018-5-14“intended use ”预期用途“性能确认”（“validation ” ）定义The term “intended use ” in these documents is established by the manufacturer or developinglaboratory at the time of assay development and has to do with the purpose and population forwhich the test was intended

27、( e.g., diagnosis , following treatment , etc.). Relevant performancecharacteristics are then determined based on the intended use of the test.The FDA and ISO both define the term “validation” as “confirmation by examination andprovision of objective evidence that the particular requirements for a s

28、pecific intended use can beconsistently fulfilled ” . （通过检查和提供客观证据证明，对一特Some people interpret “intended use ” as referring to the relevant clinical laboratory in whichthe test is performed , rather than the manufacturer or developing laboratory, thus causing定预期应用的要求始终能得到满足 ）confusion. The World Heal

29、th Organization ( WHO) defines validation as “the action (or process)of proving that a procedure, process, system equipment or method used works as expectedThe FDA and ISO terms for verification and are similar,with the distinction having to do with intended use. （性能验证和性能确认FDA和ISO术语相似，差异在后者的“预期用途”）a

30、nd achieves the intended result ” . （WHO将validation 定义为，证明所使用的一个程序、过程、系统设备或方法能按预期进行工作以及取得预期结果的活动（或过程）分子遗传检测可能的预期用途“validation” 通俗一点的定义筛查诊断the term “validation” will be used to refer to the analyticperformance characteristics that need to be initiallyestablished at the time of assay development. （指在测

31、定方法研发时，最早建立的分析性能特征 ）预测(特定情况下) ?靶向治疗药物选择治疗监测预后性能验证与性能确认的实际操作区别自建方法和自配试剂性能指标及所建议的研究要求FDA 批准的检测实验室自建方法或自配试剂（ LDT）可报告范围, 线性范围研究 (定 覆盖所述线性范围内 57个浓度，每个浓度双份检测量检测)覆盖预计测定范围内（或超出所确定的最宽的可能范围的 2030% ）79个浓度，每个浓度 23个重复检测，进行多项回归分析有严格的试剂制备SOP分析敏感性，测定下限（LOD）研究CLIA 不要求，但CAP要求对定量进行 LOD验证，使用在天内收集的20个数据点560个数据点（例如在预计的检测

32、下限范围内 5个样本，12次重复），研究时间 5天，使用probit回归分析（或如果采用 LOB研究，则使用 SD加置信限）建立相应的性能指标：重复性、准确性、特异性、测定下限精密度, 重复实验定性检测：检测1个对照/天，共20天，或双份重复 /天，共10天。定量检测：2个浓度的每1个检测2个样本（共4个样本），定性检测：最少 3个浓度（LOD、LOD+20% 、LOD-20 ），获得40个数据点。定量检测：最少 3个浓度（高、低和 LOD），双管重复检测 12次/天，检测20天，计算批内、批间、每天之间SD和/或CV，以及总的变异和抗干扰能力等加1个对照，检测 20天，或检测2个浓度，3管重

33、复，检测5天应做成一个试剂盒的样子：名称、方法、制备日期、制备人、分析特异性, 干扰研究CLIA 不要求未建议最小样本数量；检测样本相关的干扰物质（溶血、脂血、黄疸等）和遗传上相似的微生物或具有相同临床表现同一样本位点可见到的微生物，加入低浓度待测物质。采用 t检测统计分析。有效期等准确度（正确度），方法学比较研究在检测范围内的 20个患者样本或2个浓度（低和高）标准物质，复管检测25批。使用比较方法和拟评价方法至少 5天进行双管重复检测，典型的 40个以上的样本，进行 xy散点回归统计分析；采用 Bland-Altman 差异描点，加偏倚测定 ; 使用kappa统计学分析 % 符合率参考区间

34、厂家说明书内提出的参考区间在特定实验室用于其所服务的人群时可能会发生 “改变”，如果实验室希望进行验证， 需要进行参考区间研究。对于定量检测，参考区间可报告为低于最低检测限（ LOD或LLOD ）；检测可代表相应人群的 20份样本，如果人群完全不同，则通过要60份（至少40）建立参考区间。如果在健康个体靶核酸不会存在，则属于定性检测，参考范围为 “阴性”或“未检测到”，则不有使用说明书对于某些待测物，参考区间可能是一个临床决策限（ a clinical decision limit ）；如果检测的预期用途限于已知被检测的待测物是阳性的患者，则不适用参考区间。注：所有性能确认和性能验证研究必须使

35、用于适当基质中制备的样本，必须对检测的所有样本类型以及每种基因型和多重检测中的每种待测物进行评价。Burd EM. Clin Microbiol Rev. 2010152018-5-14理想的操作方法? 定量测定的精密度是测定组成步骤的变异和的平方根 (SD)= SD2 SD2 SD2 .a b c上式中SD 、SD 、SD 是步骤a、b、c等（例如试剂准备、标本采集、核酸提取、abc如果一个实验室拟采用 实时荧光PCR、ARMS、HRM或数字PCR自建肿瘤组织基因突变检测方法，如何做性能确认（validation） ?扩增和产物检测等）的标准差 改善测定精密度的措施必须首先着重在最不精密的步

36、骤上，应对试剂准备、标本收集、核酸提取、测定方法和仪器操作写出 “标准操作程序”(SOP)质量管理的发展实验室质量管理体系的建立经验管理质量手册质量检验管理统计质量管理全面质量管理（ISO9000、17025、15189）标准化+全面质量管理质量体系程序文件标准操作程序(相关记录表格 )质量管理的内涵写你所应做的做你所写的看得见的看不见的记录你已做的分析你已做的162018-5-14中国铁路通信信号集团公司 （简称“中国通号 ”）172018-5-14好习惯是生产力罗马不是一天建成的 (Rome wasnot built in a day )任何事情只要能够坚持不断去加强它，它终究会变成一种习

37、惯。质量管理“理念”的转变“人是错误的来源” 操作中的错误追根寻源往往是 管理上的问题“质量管理是科主任、组长和质控员 的职责” “质量改进是每个工作人员的职责”“培训是一种负担” “培训是一种未来投资”182018-5-14质量管理“理念”的转变质量体系文件的三大特性法规性、唯一性和适用性 “一些缺陷是主要的，一些是次要医疗临床基因扩增检验实验室质量管理办法法规性:是指文件一旦制定完成并批准实施，就必须认真执行，按照相应的文件去完成日的” 常检验工作，也就是前面所说的做你所写的。并且文件的修改不能随意，只能按规定的程序进行。“所有缺陷都是不允许的 ”ISO17025?ISO15189唯一性:

38、则是指（1）一个实验室只能有一个质量体系文件系统；（2）一项检验活动只能有唯一的操作程序；（ 3）一项规定只能有唯一的理解，不产生歧义；（ 4）只能使用文件的有效版本，无效版本在实验室的任何地方都不能使用。 “质量改进是消耗时间 ” 美国CAP“质量改进是节省时间 ”适用性:是指质量体系文件无统一格式；无标准文本；怎么做怎么写，切合实际，具有可操作性，不拘一格。所有文件的规定均应保证在临床实际检测工作中能完全做到。当发现文件有不适合情况时，则应立即按规定程序对文件进行修改。编号：SOP （5W和1H）XXX单位XXX实验室XXX标准操作程序启用日期：版本：第 页 共 页一目的：为什么做（Why

39、）：目的做什么(What)：适用范围何时（When）：适用范围何地（Where）：适用范围谁来做(Who)： 责任人二适用范围：三职责或责任人：四（方法原理）五（检测设备和试剂）六（所需的环境条件）七操作步骤：1怎样编写SOP ?23五、本操作程序变动程序：六、相关的文件七、相关的记录表格和报告编写人审核人批准人如何做（How）：操作步骤实验室质量管理的 “灵魂”如何实现SOP的“可操作性”?标准操作程序（SOP）是实验室的“最高标准”！“文字”加“图片”的SOP等于试剂盒说明书吗 ?SOP能给我们带来什么?源于一些标准文件（如仪器试剂说明书、国际国内标准文件 ）和实验室实际工作经验积累。因此

40、高于相关标准文件！有可操作性的SOP及全员遵循是质量管理的“灵魂”！192018-5-14SOP装订成册?有一个SOP很容易有一个可操作性的SOP很难吗?SOP的第一版、第二版、第三版、 ?SOP文件在什么时候需要修改 ?202018-5-14“修”一个东西的前提是这个东西一定是出了 “问题”或“故障”！实验记录表格的设计发现SOP有“故障”的途径：室内质控和室间质评失控、差错、投诉、评审的不符合项、存在问题表格种类繁多重复记录表格无实用性，用于检查的痕迹很重212018-5-14记录表格设计的基本原则临床基因扩增检验流程记录表检验日期使用说明：检验项目：扩增仪中保存文件名：1本记录表须严格遵

41、循试剂准备区 标本制备区扩增区（产物分析区）单一流向移动，严禁逆向移动。2各项工作执行后，在相应叙述前的 ”内打“”。3本记录表最后与相应的标本接收记录等归档保存于扩增区的专用文件柜内，以备查找。信息充分“简单明了实验前准备试剂在有效期内生物安全柜的滤膜在使用有效期内冲眼器内无菌生理盐水在有效期内扩增仪、加样器和温度计在校准的有效期内消毒溶液在有效期内离心管、带滤芯吸头已经过质检合格临床标本的检测信息能有机联系起来融入LIS系统?操作者：试剂准备区（1区）标本制备区（2区）实验台面清洁（水或 70%酒精擦拭）冰箱（柜）温度：冷藏室（ 28） ； 冷冻室（182）实验室温度： （允许范围：103

42、0）；相对湿度： （允许范围：30%70% ）实验前 ：打开通风设备实验台面清洁（水或 70%酒精擦拭）； 冷冻室（182）实验前：打开通风设备冰箱温度：冷藏室（ 28）实验室温度： （允许范围：1030）；相对湿度： （允许范围：30%70% ）PCR试剂来源： （可直接列出有关厂家名称） 批号：人份，剩余量：阳性室内质控物来源：阴性室内质控物来源：浓度及批号：批号：扩增位置：扩增位置：检验项目：本次实验用量：人份。其他有关试剂配制：所取理的标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：12345678917181920212223242526272829303132按XXX（将有关SOP编号

43、列出）SOP配制1%含氯消毒液按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制4NaOH溶液按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制0.1%焦磷酸二乙酯毫升；毫升；毫升；101112131415按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制毫升；其他：16仪器设备使用：核酸提取及加样过程：按 XXX（列出编号）SOP进行。仪器设备使用： 生物安全柜： 正常 不正常 恒温仪温度校准：离心机： 正常 不正常 振荡器： 正常 不正常XXX SOP SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。离心机： 正常不正常振荡器： 正常不正常实验后： 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机

44、，并进行紫外照射30分钟以上。实验后：按（将有关编号列出）按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：操作者：扩增及产物分析区（3区）人员培训实验前实验室温度： （允许范围：1030）；相对湿度： （允许范围：30%70% ）扩增仪操作： 开机自检及运行正常 按XXX（列出编号）SOP进行编程、参数设定）Intercept值： r值：打开通风设备实验台面清洁（水或 70%酒精擦拭）方法原理标准曲线计算值：Slope值：（）（）室内质控结果：结果：填写室内质控记录、描质控图 是否失控：否 是核酸扩增检测的关键环节仪器设备使用

45、、维护和校准结果的分析、报告及进一步处理质控的分析失控原因及分析：（失控判断标准及原因分析按 XXXSOP进行）知其然又知其所以然 。实验结果：见所附扩增仪打印结果实验后： 按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：222018-5-14实验室内部培训存在的问题实验室人员内部培训的重要性人员少，实际上没有内部培训形式外部培训提供的是 “理念”，是被动的，更多的是“学习”内部培训是主动的，源于实践，高于实践，更多的是“思考”没有年度培训计划没有培训记录需要我们来思考的几个问题 ?内部培训最好的第一手培训教材

46、是什么 ?内部培训最好的第一手培训教材 是什么?内部培训最重要的培训内容是什么?如何进行人员能力评估?标准操作程序（SOP）是指导实验室人员日常工作的“最高标准”！是人员进入到实验室后 ，内部培训时，最好的第一手人员培训教材！试剂、方法原理如何培训讲座内部培训所涉及的范围专业其他质量控制方法相关领域的新技术理论操作相关法律法规质量管理体系讨论自学新理念和新进展仪器设备使用、维护和校准咨询练习实验操作技能232018-5-14书面考试（个体的）差错发生率是否阅读过所从事领域的文献并实际应用实验考核真失控率讨论心得培训评估能力评估由实际工作而产生的论文或案例分析被投诉率论文综述问题的解决报告分析问

47、题解决问题的能力室内质控方法非统计学方法 在检测临床标本的同时，检测一定数量（ 与临床样本的数量相适应 ）的已知弱阳性（与试剂宣称的测定下限相适应） 和阴性的质控样本非统计学 方法统计质控方法 检测有效的质控判断方法 ：阳性检测为阳性（反应性），阴性检测为阴性（非反应性）。SNP、突变等定性检测质控品从哪来 ?突变及SNP每批检测的质控如何做 ?日常检验阳性样本的收集或永生化细胞系，制备成含一定比例突变的质控样本每批临床标本检测：带入其中 12种突变或基因型较弱阳性（一定突变%）样本以及野生型样本，随机放置于临床标本中间进行检测。在一定时间内将所有已有质控品的突变全部轮到弱阳性质控品：浓度为试

48、剂盒检测限 2-4倍的样本较强阳性质控样本?。阴性质控品：日常检验的阴性标本或从野生型细胞系制备得到质控规则：弱阳性质控样本检测为相应阳性，阴性为野生型，即为在控。否则为失控。242018-5-14常用统计学质控方法质控物浓度的选择定量测定：测定线性范围内的高、中、低三种浓度定性测定：接近方法测定下限（ 2-4倍）的浓度Levey-Jennings 质控图假阳性统计质控方法阴性质控物临床基因扩增检验IQC统计计算问题室内质控品的放置可使用质控样本扩增后的 IU/ml来进行统计计算，也可用每隔一定数量（ ?随机? ）的临床标本加入一个其对数值进行。质控品（定性包括阳性和阴性）由于基因扩增结果的原

49、始数据通常很大，可能不呈正态分布，故使用其对数值来进行质控统计分析。Levey-Jennings 质控图252018-5-14常用质控规则的符号及定义符 号定义12S13S22SR4S1个质控测定值超出均值 2SD控制限1个质控测定值超出均值 3SD控制限2个连续的质控测定值同时超出均值 +2SD或2SD控制限同一批测定中，2个不同浓度质控品测定值之间的差值超出 4SD控制限41S7T4个连续的质控测定值同时超出均值 +1SD或1SD控制限7个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化10个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧10X262018-5-14多规则质控QC DataConcept

50、 1977Example 198112sReport Resultsu“WestgardRules”13s22sR4s41s10 xTake Corrective Action“假阳性”的统计学室内质控方法基于日常检验的阳性率比值半Levey-Jennings 质控图法基于日常检验的阳性率比值（ 呈正态分布）直接概率计算方法（不呈正态分布）272018-5-14质控规则可能的几种失控表现 当阴性质控样本为阳性时 ,不管阳性率测定比值为何，均为失控，所曲线向上漂移：提示出现污染，污染可能是由于某一天操作上的失误导致实验室被污染如标本泄漏，产物泄漏，试剂被污染等有阳性标本须重新测定，并增加一倍阴性

51、质控样本。 如果阴性质控样本为阴性，某次测定阳性比值超出 +3SD,则为失控,为1+3S规则。本次结果阴性结果根据阳性质控样本的情况 ,决定是否可以发出,所有阳性样本结果不能发出，需查找出现阳性率增高的原因，并在增加一倍阴性质控样本的情况下重新检测。向上的趋势性变化：可能存在累积性的产物污染，实验室扩增产物逐渐累积，从而使病人结果的阳性率逐渐增高。此时实验室需要进行彻底清洁直接概率计算法根据二项式分布的概率计算按统计学规律，一个事件发生的 概率小于5%被称为小概率事件，即发生的可能性很小。在一个实验室中某检测项目结果 的阳性率为p,计算在n个样本中有k个阳性结果的概率。根据二项式分布的概率计算

52、公式如下：当一个小概率事件发生时，则可能有误差存在，有必要对其发生的原因进行分析。P(X=k)=n!/k!(n-k)!p k(1-p)n-k其中n为当次实验检测标本数， k为阳性个数，p为阳性率。对每天的日常病人结果中阳性率出现的概率进行计算，如果这种结果出现的概率小于 5%时，则可判为失控。P(X=k)5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。根据二项式分布的概率计算根据泊松分布的概率计算在临床检测中，一些检测项目如 HCV RNA 、CT、结核杆菌、淋球菌的阳性结果率均较低，这时虽然可以使用公式（1）计算概率，但如果标本量很大，使用泊松分布来估计二项式分布是一种

53、更为简便的方法。 如果一个实验室检测某项目，平常病人结果的阳性率为 10%，即p=0.1, 在某一次检测25（n）个样本出现6（k）个阳性结果，19个阴性结果，则检测过程中是存在污染的可能性可通过下述方法计算。即计算在 25个样本中出现6个或6个以上阳性结果的概率，此时的概率为 1-（获得0个或1个或2个或3个或4个或多5个阳性结果的概率）即： P(X=k)1-P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)=1-(1-0.1) 25+25(1-0.1) 240.1+300(1-0.1)230.12+2300(1-0.1) 220.13+12650(1-0.1) 210.14+53130(1-

54、0.1) 200.15=0.0334根据泊松分布，可使用下式计算概率：P(X=k) =(np)ke-np/k! 则在这个实验室一次检测 25个标本获得6个阳性结果的概率为 3.34%，小于5%，属于小概率事件，即发生的可能性很小，可能有污染所致假阳性结果的可能。P(X=k)5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。282018-5-14根据泊松分布的概率计算标本间交叉污染的概率计算在临床检测的一些项目中， 如果所有阳性结果的出现是连续性的，则可能存在标本间的交叉污染 ，即阳性样本污染了它邻近的阴性样本，这种情况的概率计算公式如下：一个实验室中，某项目每次检测结果的阳

55、性率约为 2%（p），则在100（n）个样本中出现8（k）个阳性结果的概率。P=(n-r+1)/n!/r!(n-r)!根据泊松分布，可使用公式（ 2）计算概率，此时n=100,p=0.02,k=8, np=2 代入公式计算得其中n为当次实验检测标本数， r为连续出现阳性或阴性的个数。P(X=10) =28e-2/8!=0.00090.09%。当某次实际测定标本连续阳性的概率大于所计算的概率，则判为失控。阴性标本结果可以发出，阳性标本要考虑标本间交叉污染的问题。分析你已做的标本间交叉污染的概率计算如在一次检测100个标本的某项目检测中，所有 2个阳性结果每次实验结果的分析表象与真象连续出现的概率

56、为：P=(100-2+1)/100!/2!(100-2)!=99/4950=0.02 概率为2.0%。因此，如在100个标本中，连续出现两个为阳性次数有 3次，即概率为3.0%，则为失控。多次实验结果的综合分析趋势的内在含义而在一次检测100个标本，所有3个阳性结果连续出现的概率为：P=(100-3+1)/100!/3!(100-3)!=98/161700=0.0006 概率为0.06%。因此，如果如在100个标本中，连续出现三个为阳性次数有 1次，即概率为1.0%，为失控。仪器设备的使用情况分析维护与校准周期的有效性实验室质量管理的 “精髓”全面质量管理的工作循环 :PDCA两部委共同发布公

57、告 今天起国内不能卖这种油 |普通|柴油._新浪财经 2017.10.31预防！4个阶段，8个步骤查出异因 第一阶段（Plan）有4个步骤：分析并找出问题；找出问题产生的 原因；确定PlanDoCheckAction采取措施保证消除不再出现纳入标准防止同样的问题出现第二次是质量管理的“精髓”！最主要原因；制定改进措施计划。 第二阶段（Do）有1个步骤：执行计划北京及全国性雾霾的原因：工厂废气、汽车尾气、油烟、工地扬尘、烧煤 第三阶段（Check）有1个步骤：检查计划执行情况。 第四阶段（Action）有2个步骤：总结、制定标准（修改质量文件） ，以巩固提高；发现新出现的问题 ，转入下一PDCA

58、循环。环保部:机动车污染已成中国空气污染的重要来源_新闻频道_央视网(. 2017.6.6环境保护部大气环境管理司司长刘炳江说， 2016年，全国机动车排放污染物初步核算为 4472.5万吨，比2015年削减1.3%。其中，一氧化碳 (CO)3419.3 万吨，碳氢化合物(HC)422 万吨，氮氧化物 (NOx)577.8 万吨，颗粒物(PM)53.4 万吨。汽车是污染物排放总量的主要贡献者 ，其排放的CO和HC超过80%，NOx和PM超过90%。SO2由发电厂排放，二氧化氮来自发电厂和汽车，与硫酸发生中和反应的氨大多来自化肥和汽车尾气。伦敦雾霾是酸性的，中国雾霾是中性的Natl Acad S

59、ci A. 2016 Nov 29;113(48):13630-13635. ProcUS174292018-5-14PDCA的特点分析用质控（图）小环合成大环不断循环，阶梯式上升“A”是改进的动力之源ACPDACPD175控制用质控（图）阳性质控样本失控的常见原因核酸提取中的随机误差 。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留、所用耗材如离心管有PCR抑制物等。仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。试剂的问题。如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。阴性质控样本的常见失控原因阳性质控样本测定结果偏低

60、或为阴性结果偏低阴性观察临床标本情况临床标本中无强阳性临床标本中有较强阳性临床标本中有阳性临床标本全为阴性随机误差扩增产物的“污染”系统误差所用离心管含抑制物T a性降低q酶活核酸提取试剂效率低核酸提取中靶核酸丢失核酸提取中抑 抑物残留核酸提取试剂混入扩增仪孔间温度差异Taq 酶或逆转录酶失活验证重新提取或已知浓度 DNA在同一孔内扩增更换试剂临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉更换进口离心管更酶再检测换T aq更换核酸提取试剂结果正常结果仍低“污染”检测质控样本及 35份已知阳性样本进行扩增仪孔温度校准后再检测措施所有标本重新检测质控样本测定正常且阳性样本有些值增加质控及已知阳性样本测