生物化学A（上）6-蛋白质化学4-高级结构

1、蛋白质的高级结构超二级结构和三、四级结构一级结构：氨基酸序列及二硫键位置 二级结构：螺旋，折叠 超二级结构 Module 结构域（domain） 三级结构：所有原子空间位置 四级结构：蛋白质多聚体蛋白质的结构层次高级结构超二级结构（Supersecondary structure）超二级结构是介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构，指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有、和等。多数情况下只有非极性残基侧链参与这些相互作用，而亲水侧链多在分子的外表面。超二级结构类型

2、形成超二级结构的作用力形成超二级结构的作用力-sheet 的拓扑学规律超二级结构Supersecondary Structure超二级结构的类型：keratin, myosin, 、：拥有-sheet的蛋白质： 螺旋的侧链位置的20度错位：伸展肽链的12.5度自然扭曲形成超二级结构的作用力蛋白质中的几种超二级结构 Rossman折叠（螺旋处于折叠片上侧）发夹曲折希腊钥匙拓扑结构 超二级结构 是一种由两股右手-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋(superhelix)，重复距离约140 。是-角蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白(protomyosin)和纤维蛋白原(fibrinogen)中的一种超二级结构。

3、由于形成超螺旋，每圈螺旋为3.5个氨基酸残基（不是3.6），沿轴有一定的倾斜，重复距离从5.4缩短到5.1。螺旋之间的相互作用由侧链的装配控制，螺旋之间可能作用的侧链是非极性的，它们向着超螺旋内部，避开与水接触，其他的是极性的，处于分子的表面，与水接触。超螺旋的稳定性主要由非极性侧链间的范德华力相互作用的结果。超螺旋细胞色素C的结构 是一种螺旋束,经常是由两股平行或反平行排列的右手螺旋段相互缠绕而成的左手卷曲螺旋或称超螺旋。螺旋束中还发现有三股和四股螺旋。卷曲螺旋是纤维状蛋白质如角蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白的主要结构元件，也存在于球状蛋白质中。肌球蛋白（Myosin）肌球蛋白是一种马达蛋白(m

4、otor protein)，在肌肉收缩和细胞分裂中起重要作用，由Kuehne于1864年在研究骨骼肌收缩时发现并命名 。Mr 550000，6个亚基：2条重链(Mr 200000)，4条轻链(2L2 18000，L1 16500，L3 25000)，状如“Y”字，长约160 nm。在肌球蛋白超家族中，头部区域都有相当高的同源性，特别是ATP和肌动蛋白的结合位点非常保守，头部具ATP酶活性。两条重链的氨基末端分别与两对轻链结合，形成两个球状的头部和颈部调节结构域，称为S1(subfragment 1)，余下重链部分组成肌球蛋白长杆状的尾部。 Meromyosin:酶解肌球蛋白Ribbon rep

5、resentation of myosin S1 fragment. The heavy chain is in grey, the two light chians in two shades of blue.超二级结构最简单的组合是由二段平行的-链和一段连接链组成，此超二级结构为单位。连接链或是-螺旋链或是无规则卷曲。最常见的组合是由三段平行的-链和二段-螺旋链构成-Rossmann-折叠。 -曲折和回形拓扑结构是（）组合的两种超二级结构。 -曲折(mander)是另一种常见的超二级结构，相邻的三条反平行-链通过紧凑的-转角连接而成。折叠在蛋白质中的不同形式在蛋白质中(Rossmann折叠

6、)理论上四条折叠有12种组合， 但是 Greek key 的由来回形拓扑结构，反平行-折叠片中常出现的超二级结构，这种结构直接用希腊陶瓷花瓶上的一种常见图案命名，称为“Greek key”拓扑结构。有两种可能的回旋方向，实际上只存在一种，什么基础还没有确定。 - sheet 模式之一- sheet模式之一 - sheet 模式之二 - sheet 模式之三细胞核抗原的结构 纤溶酶原的结构 锌指结构 (螺旋-折叠-折叠模序) 转录因子MyoD的螺旋-环-螺旋模序结构域 (Domain)也称辖区，空间上相对独立，是进化过程中不同基因融合的结果。结构域是在二级结构或超二级结构的基础上形成的三级结构的

7、局部折叠区，一条多肽链在这个域范围内来回折叠，但相邻的域常被一个或两个多肽片段连结。通常由50-300个氨基酸残基组成，其特点是在三维空间可以明显区分和相对独立，并且具有一定的生物学功能，如结合小分子。模体或基序（motif）是结构域的亚单位，通常由2-3个二级结构单位组成，一般为螺旋、折叠和环（loop）。 免疫球蛋白中的结构域蛋白质的三级结构 (Tertiarystructure)蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折叠形成具有一定规律的三维空间结构，称为蛋白质的三级结构。蛋白质每个原子的空间位置，其主要研究方法是，X-光衍射和核磁共振法。现也有认为蛋白质的三级结构是指蛋白质

8、分子主链折叠盘曲形成构象的基础上，分子中的各个侧链所形成一定的构象。侧链构象主要是形成微区(或称结构域domain)。对球状蛋白质来说，形成疏水区和亲水区。亲水区多在蛋白质分子表面，由很多亲水侧链组成。疏水区多在分子内部，由疏水侧链集中构成，疏水区常形成一些“洞穴”或“口袋”，某些辅基就镶嵌其中，成为活性部位。 维持蛋白质三级结构的作用力氢键(Hydrogen Bond) 在稳定蛋白质的结构中起着极其重要的作用。多肽主链上的羰基氧和酰胺氢之间形成的氢键是稳定蛋白质二级结构的主要作用力。此外，还可在侧链与侧链，侧链与介质水，主链肽基与侧链或主链肽基与水之间形成。范德华力(Van Der Waal

9、s Forces） 范德华力包括吸引力和斥力。吸引力只有当两个非键合原子处于接触距离（contact distance)或称范德华距离即两个原子的范德华半径之和时才能达到最大。就个别来说范德华力是很弱的，但其相互作用数量大且有加和效应和位相效应，因此成为一种不可忽视的作用力。疏水作用（Hydrophobic Interaction) 介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部，这一现象称为疏水作用，它在稳定蛋白质的三维结构方面占有突出地位。疏水作用其实并不是疏水基团之间有什么吸引力的缘故，而是疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。蛋白质溶液系统的熵增加是疏水作用的主要动

10、力。当疏水化合物或基团进入水中时，它周围的水分子将排列成刚性的有序结构即所谓笼形结构(clathrate structure)。与此相反的过程（疏水作用），排列有序的水分子（笼形结构）将被破坏，这部分水分子被排入自由水中，这样水的混乱度增加即熵增加，因此疏水作用是熵驱动的自发过程。盐 键（Ion Interaction）又称盐桥或离子键，它是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。吸引力与电荷电量的乘积成正比，与电荷质点间的距离平方成反比，在溶液中此吸引力随周围介质的介电常数增大而降低。在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可

11、形成离子键。盐键的形成不仅是静电吸引，而且也是熵增加的过程。升高温度时盐桥的稳定性增加，盐键因加入非极性溶剂而加强，加入盐类而减弱。 二硫键 (Disulfide Bond）绝大多数情况下二硫键是在多肽链的转角附近形成的。二硫键的形成并不规定多肽链的折叠，然而一旦蛋白质采取了它的三维结构，则二硫键的形成将对此构象起稳定作用。假如蛋白质中所有的二硫键相继被还原将引起蛋白质的天然构象改变和生物活性丢失。在许多情况下二硫键可选择性的被还原。 X-射线衍射，通过对材料进行X-射线衍射，分析其衍射图谱，分析材料的成分等。 X-射线（光）衍射（X-Ray Diffraction, XRD）X-射线 (X-

12、ray)X-射线是一种波长很短的电磁辐射，其波长约为(20-0.06)10-8 cm之间。伦琴射线具有很高的穿透本领，能透过许多对可见光不透明的物质，如墨纸、木料等。这种肉眼看不见的射线可以使很多固体材料发生可见的荧光，使照相底片感光以及空气电离等效应，波长越短的X射线能量越大，叫做硬X射线，波长长的X射线能量较低，称为软X射线。 X射线衍射原理产生原因晶体由有序排列的质点组成，当x-ray与质点相遇时，首先被晶体各个原子中的电子散射，每个电子都是一个新的辐射波源，其波长与原射线相同。原子在晶体中是周期排列，散射波之间存在着固定的位相关系，它们之间会在空间产生干涉。衍射：原子在晶体中的周期性排

13、列使得x-ray散射在一些特定的方向加强，而在其它方向减弱的现象。x-ray衍射实质：大量原子散射波互相干涉结果。散射是衍射的基础，而衍射则是晶体对x-ray散射的一种特殊表现形式，并非x-ray与物质相互作用的新现象。X-射线的衍射x-ray射入样品，其背后放置照相底片。 非晶体：沿x-ray传播方向形成一个斑点。 晶体：除透射束形成的中心斑点外，周围还有有规律分布的其它斑点。说明有偏离原入射方向的x-ray存在。x-ray遇到晶体后所产生的上述现象称为x-ray的衍射，偏离原入射方向的射线称衍射线，底片上出现的图形称衍射图，图上的斑点称衍射斑点。利用x-ray研究晶体结构中各类问题，主要是

14、通过x-ray在晶体中产生的衍射现象进行的。1895: W. C. Roentgen discovered X rays. 1912: Max von Laue discovered X-ray diffraction by crystals. 1913: W. L. Bragg reported the crystal structure of NaCl, providing the first experimental evidence for the absence of salt molecules. 1928: Kathleen Lonsdale reported the struc

15、ture of benzene as having six equal sized bonds instead of alternating double and single bonds.1935: J. M. Robertson et al. solved the structures of phthalocyanines（苯二甲素颜料）, the first case of a complex organic molecule solved independently by crystallography. 1948: Bijvoet et al. solved strychnine(士

16、的宁，左旋肉碱酒石酸盐）, perhaps the first case in which crystallography decided between alternatives proposed by organic chemists. 1950: Bijvoet et al. established the absolute configurations of dextro and laevo compounds with NaRb tartrate. 1949-57: Dorothy Crowfoot Hodgkin et al. solved the structures of pe

17、nicillin (1949) and vitamin B-12 (1957). She won the Nobel Prize in Chemistry in 1964. X-RAY DIFFRACTION技术的历史 X-RAY DIFFRACTION研究蛋白质的立体结构 1936年Max F. Perutz开始用X-光衍射技术来研究血红蛋白的立体结构； 1945年Perutz的学生J. C. Kendrew开始研究肌红蛋白的结构；1957年肌红蛋白的结构确定, 1959年血红蛋白结构解明；两人于1962年获得诺贝尔化学奖。KendrewPerutzL. Braggs蛋白质几种不同的立体结构

18、表示法核磁共振是确定蛋白质分子在溶液中的动态结构的唯一方法Kurt Wuthrich,瑞典科学家2002年获得诺贝尔奖胰岛素的三级结构溶菌酶的三级结构磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构-折叠形成内桶和-螺旋组成的外桶蛋白质的四级结构蛋白质与蛋白质的相互作用，蛋白质与核酸的相互作用，比较简单的体系有血红蛋白、限制性内切酶等，复杂体系有核糖体、病毒、肌肉蛋白等。蛋白质的四级结构（Quaternary structure)指蛋白质分子中亚基的立体排布，亚基间的相互作用与接触部位的布局。亚基(subunit)就是指参与构成蛋白质四级结构的、每条具有三级结构的多肽链。单条多肽链组成的蛋白质分子没有四级

19、结构；一般是一条多肽链形成一个亚基。亚基可相同或不同。亚基单独存在无活性；维系蛋白质四级结构的是氢键、盐键、范氏引力、疏水键等非共价键。血红蛋白(hemoglobin)的四级结构寡聚蛋白质，四个亚基，两个（141 AAs)两个(146AAs），四个亚基占据四面体的四个角。血红素辅基位于分子表面的空穴里，每个亚基一个辅基。四个氧的结合部位保持一定距离。每个链与每个链接触，同亚基间很少有作用。蛋白质四级结构与功能的关系变构效应当血红蛋白的一个亚基与氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结合力迅速增高，使血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形。这种由于蛋白质分子

20、构象改变而导致蛋白质分子功能发生改变的现象称为变构效应。血红蛋白的变构作用血红蛋白的氧饱和曲线DNA和蛋白质的相互作用也是四级结构病毒是巨大的蛋白质四级结构复合体核糖体，蛋白质和核酸的复合体蛋白质的一级结构决定高级结构蛋白质从伸展的多肽链形成其特定的立体结构的过程叫折叠（folding）。维持其特定的立体结构的作用力为：氢键、疏水作用、范德华力、离子键和配位键。多数蛋白质被合成以后，自己就能形成自由能最低的立体结构。蛋白质的一级结构决定其高级结构。换言之，蛋白质的三维立体结构完全取决于其氨基酸的序列。蛋白质的天然立体结构一般是自由能最低的状态。Anfinsen （1972诺贝尔奖获得者）用极其

21、简单的实验证明了 蛋白质的一级结构决定 其高级结构。蛋白质的一级结构决定高级结构Anfinsen的实验Anfinsen的实验（续）可恢复到原活力的95-100%重新形成的四对二硫键与原来的完全一致Anfinsen的实验（续2）蛋白质以多肽链的形式被合成出来后，要形成特定的立体结构后才有生理活性。拥有生理活性的立体结构对每种蛋白质而言，是特定的和唯一的，通常称之为天然结构（native structure）。蛋白质的天然立体结构在溶液中有一定的可塑性（弹性）。 有些蛋白质被合成以后，自己不能独立形成自由能最低的立体结构，而需要一类蛋白质来催化，这类蛋白质称为分子伴侣 （ molecular ch

22、aperone）。它们普遍存在于真核生物和原核生物中，一般使用ATP的能量帮助其它蛋白质形成自由能最低的立体结构，但不改变自己。 蛋白质在受热或在高浓度的尿素、盐酸胍等化学试剂存在下会丧失活性，该现象称为蛋白质的变性（denaturation）。蛋白质变性的的化学本质是高级结构的破坏（一级结构不被破坏），特别是氢键的破坏。有些蛋白质的变性是可逆的，通过适当的方法（如透析）将变性剂除去后，蛋白质可以恢复其天然立体结构，这个过程称为复性（renaturation）。蛋白质结构与疾病 生物体内的每一个基因均受到来自生物演化的选择压力，其结果是每个蛋白质均有其独特（和唯一的）的立体的结构和生化生理功能

23、。蛋白质立体结构的改变可能引起人类或动物的疾病。蛋白质立体结构的特定和唯一性库鲁病克-雅二氏症疯牛病20世纪末，人们最害怕的动物是牛-从英格兰蔓延出来的疯牛病。1985-4-25，英国农场原本温顺安静的乳牛变得有攻击性、紧张、动作失调。宰杀后作为饲料，18个月后，该农场又有7头母牛生病死亡。1987，疯牛病蔓延到英格兰和威尔士各地农场的牛群。1995年5月一只猫的死亡(症状与牛一样）引起了全国性恐慌，4年内死了62只猫。1993年，两名英国奶农死于克-雅二氏病。库鲁病（新几内亚）仅发生于妇女和儿童（步态紊乱-颤抖-手足失济-瘫痪-不能吞咽-饿死或渴死），但头脑清楚、没有炎症。脑中有大量淀粉样蛋

24、白（amyloid)。1730最早报道的神秘疾病-羊瘙痒症，19世纪大流行，20世纪只是一种地方性疾病。1963年，研究发现库鲁病的传播与富雷人食人有关（食用尸体是妇女和儿童的特权，所以男人很少得库鲁病），1965证实是一种传染病，且能跨种传播。朊病毒（Prion）也称传染性蛋白粒子/朊粒/朊病毒。是一种不同于细菌、病毒或类病毒的在分类上尚未定论的病原因子。其本质为由正常宿主细胞基因编码的、构象异常的蛋白质，称为朊蛋白(prion protein, PrP)，目前尚未检出任何核酸成分，是人和动物的传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathie

25、s, TSEs)的病原体。 一条肽链对应一个特定的空间结构，这条法则的破坏是灾难性的。导致疯牛病的prion就是一个例子。正常prion异常prion1982年，美国学者Prusiner提出用 proteinaceous infection particle的字头组成Prion一词，作为TSE 的病原。因此荣获1997年Nobel医学奖。1996年底美国Nature评出最有影响的十大科研成果中，“成功发现PrPsc是疯牛病和人CJD的病因”为第四条。 Prion 是一种不含核酸和脂类的疏水性糖蛋白，分子量为27-30103，因此又称为PrP27-30。两种不同的分子构型：细胞朊病毒蛋白(cel

26、lular PrP, PrPC)：三维结构具有42%的-螺旋，3%的折叠。存在于正常组织及感染动物的组织中，是正常基因的产物，通常情况下是无害的。对蛋白酶K敏感。羊痒疫朊病毒蛋白(scrapie prion protein , PrPSC )：-螺旋占30%，折叠高达43%，仅存在于感染动物的组织中，与致病和传染有关。对蛋白酶K有抗性。 Prion在病理组织中的纤维状聚合体中枢神经细胞空泡化、弥漫性神经细胞缺失、胶质细胞增生、淀粉样斑块形成、脑组织海绵状改变等。痴呆、共济失调、震颤等中枢神经系统症状。动物prion病 人类prion病 羊瘙痒病(scrapie of sheep and goa

27、t) 库鲁病(Kuru disease) 水貂传染性脑病(transmissible mink encephalopathy,TMM) 克-雅病(Creutzfeld-Jakob disease, CJD) 鹿慢性退行性变(chronic wasting disease of deer, CWD) 格斯特曼综合征(Grestmann-Straussler Syndrome,GSS) 牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy, BSE) 致死性家庭失眠症(fatal familial insomnia,FFI) 猫海绵状脑病(feline spongifor

28、m encephalopathy, FSE) 克-雅病变种(variant CJD, v-CJD) 人和动物prion病 蛋白质结构形成总则一、蛋白质的形状分球状和纤维状；稳定的蛋白质结构倾向于拥有最多量的氢键；二、球状蛋白质都有疏水核心，由疏水侧链构成，亲水侧链分布在蛋白质的表面或酶活性中心（油滴法则），蛋白质的内部不得有空隙；纤维状蛋白也符合这一规律；三、多聚体化是球状蛋白质的普遍现象，不正常聚合成纤维状可导致疾病；四、穿膜区一定呈螺旋结构，侧链外露。 蛋白质的折叠过程很象左图中的绳子自然落下的过程，不会出现右图中的“打结”现象。The first three-dimensional st

29、ructure of a biopolymer was the DNA model built by J. D. Watson and F. H. C. Crick in 1953 taking into account fiber diffraction data provided by M. H. F. Wilkins and others (Nobel Prize in Physiology or Medicine, 1962). Here is a copy of the original paper submitted to Nature on April 2, 1953 and published on April 25, 1953.The first three-dimensional protein structures (myoglobin and hemoglobin) were determined by M. F.