高春芳-感染性疾病分子诊断及临床应用进展

1、感染性疾病分子诊断及临床应用Chunfang GAO(高春芳), Prof. & DirectorDepartment of Laboratory MedicineEastern Hepatobiliary Surgery HospitalSecond Military Medical UniversityE-mail: 报告提纲 临床分子诊断技术发展历史和现状分子杂交、分子构像、PCR、测序 感染性疾病临床分子诊断概况 基于NGS技术的HBV基因检测在慢乙肝临床管理中的应用 数字PCR在感染性疾病中的研究应用分子诊断发展历程一第一阶段 基于分子杂交的分子诊断技术上世纪60年代至80年代分子杂

2、交技术发展最为迅猛的20年遗传病分子诊断DNA印迹技术Southern blot 1975荧光原位杂交 (FISH)fluorescence in situ hybridization 1977ASO反向斑点杂交 ASO (ASO-RDB) 1980allele-specific oligonucleotide reverse dot blot多重连接探针扩增技术 MLPAMultiplex ligation-dependent probe amplification历程二-基于分子构象的分子诊断技术(一) 变性梯度凝胶电泳 (denaturing gradient gel electroph

3、oresis，DGGE)单链构象多态性1970-1980年(single strand conformation polymorphism，SSCP)(二) 变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography，dHPLC)1997年(三) 高分辨率熔解分析 (high-resolution melting analysis，HRMA)2003年 Wittwer 等首次革命性地使用过饱和荧光染料将PCR产物全长进行荧光被动标记，再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进行鉴定分子诊断发展历程三-PCR 定性 PCR 定量PCR实时荧

4、光定量PCR (real-time PCR)1.双链掺入法2.Taqman探针3.分子信标4.双杂交探针 数字PCR分子诊断发展历程四-核酸测序 Sanger sequencingABI 在Sanger法的基础上，推出了首台商业化DNA测序仪PRISM 370A，并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射自显影检测体系Sanger加减法/酶法DNA序列测定的方法-ddNTP1975197719861995ABI 推出首台毛细管电泳测序仪PRISM310更是使测序的通量提高Maxam/Gilbert化学修饰降解法Sanger测序是最为经典的一代测序技术仍是目前获取核酸序列最为常用的方法

5、HGP and Sanger Sequencing3.2 billion basesDr. Fred SangerDouble Nobel laureatee and the developer ofdideoxy sequencing method, first published inDecember 1977Fred Sanger is a quiet giant, whose discoveriesand inventions transformed our research world.”(A.Bradley, WTSI.)分子诊断临床应用肿瘤感染性疾病遗传病预测风险预测病程预测预后

6、预测诊断辅助诊断分子/基因分型分子诊断生殖健康药物基因组慢病管理治疗指导个体化用药疗效监测、耐药监测随访病程动态监测生存、复发监测感染性疾病分子诊断临床应用项目种类 病毒： 种类繁多 细菌： 结核分枝杆菌、幽门螺杆菌、沙门/志贺氏菌等 真菌：念珠菌等 衣原体、支原体、脲原体等 基因型及耐药基因-涉及技术 PCR (荧光探针法、RNA恒温扩增) 分子杂交+PCR（反向杂交、芯片法） 微流控+PCR 测序法等3/28/2018病原体相关分子检测的关注热点 病原体核酸定量检测敏感性、自动化、准确（绝对）定量 病原体基因变异检测 基因分型 多耐药位点检测 高危预测 POCT 化 特殊、复杂样本的检测能

7、力基于NGS技术HBV基因分析在CHB临床管理中的应用1. 用于抗HBV 核苷（酸）类似物耐药突变位点及基因型定量研究和应用2. 原发性肝癌高危变异位点研究用于临床肝硬化/肝癌预测和预后监测3. HBV 变异与临床乙肝标志物及cccDNA的相关研究用于临床检测结果的正确诠释HBV DNA结构P区：2357-0-1621S区：2848-833X区：1374-1836C区：1814-2450P区结构示意图RTRNA ase-H116128401301129rt1GFABCDErt344Catalytic Region in RT Region:G(aa24-36) F(aa37-47) A(aa7

8、5-90) B(aa159-182) C(aa200-210) D(230-241) E(247-257)突变类型 Primary: 是指对核苷酸类似物敏感性减弱直接相关 Compensatory: 补偿性变异不直接与耐药有关，但能 修复病毒的复制能力 Putative: 推测该突变位点与耐药相关，但未得到证实 Pretreatment: 发现于核苷酸类似物治疗前Liu, B. M. Antiviral Res.2010耐药相关的突变位点类型突变类型突变位点抗病毒药物ETVI169T,S202C/G/I,M250I/L/VI163V, A186T, T184A/C/F/G/I/L/M/S主要耐

9、药突变（primary）A181T/VLAM, LDT, ADV,TNFLAM, ETV, LDT, TNFADV,TNFM204I/V/SM236T,A194TL80I/V,V173LL180M补偿性突变(compensatory)LAMLAM, ETV,LDTS53N, L82M, I91L,T128I/NN139T, W153Q, V191I, A200V, V207I,L229G/V/WLAM推测耐药突变(putative)T54N,V84M,S85A,Y126CS213T,V214A,L217R,E218D,F221Y,I233V ADV,P237H,N238D/S/T,Y245HS

10、/C256GLAM,ETVV191I,Q215P/SLAM,ADV治疗前突变(pretreatment)T38A,Y124H,D134E,N139K/H,I224V,R242A发现于治疗前Sanger测序 一代测序HBV核酸提取PCR富集目标片段目标片段纯化定量测序PCR测序数据分析测序产物纯化 一次只能对一个片段进行测序 测序时间 1.5-2天 读长相对较长，600-800bp 背景噪音难克服，难以确认低频突变HBV RT区 NGS 测序过程HBV核酸提取PCR富集目标片段目标片段纯化定量PCR文库构建Q-PCR文库质检测序数据分析高通量测序碱基质量评估方法：Q20=-10log(0.01)

11、，每个碱基出错的概率为0.01去除Reads数不足500的样本数据分析过程形成pipeline，进行流程化分析测序深度与模型预测效能关系样本reads2000-2500 时，分类模型AUC不再上升不同耐药突变检测方法比较HBVDNA定量样本反向斑点杂交一代测序基因型C二代测序位点基因型位点位点和频率(%)基因型(%)#151#1573.313.78WTWTCWTWTB/C (25.4/74.6)B/C (45.1/54.9)CCWTCCWT180M204V180M204V180M(98.5)204V(99.28)#130#1564.61C (99.9)C (99.0)180M204V202S/

12、GL180M204V180M(90.1)5.056.40B/CCC204V/I(97.02/1.53)202G(92.9)S202G181T250L#9WTCCWTC (99.3)C (99.5)#846.836.91204VCC181T181T (30.73)#70#87204I204 IWTCC180M (17.4) 204I(99.0)WTC (99.1)C (98.3)第三部7.41204M/V C二代测序与一代测序结果符合率高，并可检出低频突变位点SDCV(%)CV(%)批间组别样本均数批内12345678998.95 0.25599.07 0.17298.40 0.1520.258

13、高突变组M204(20%)0.1740.1550.56517.4518.5317.601.530.722.211.680.140.150.194.13911.9529.562中突变组M180(5-20%)3.5079.436低突变组I2041.0314.61113.36319.777(5%)1.40同一样品分成三份，连续检测三天二代测序检测批内及批间CV20%，精密度较好质控体系QC1QC2L180MM204I(%)混合样品编号 混合百分比(%) 混合百分比(%)(%)QC110080604020002040608010023.231.640.048.456.867.425.336.547.7

14、58.870.086.1level1level2level3level4QC2L180M(%)M204I(%)预期突变率(%)测序结果平均突变率(%)预期突变率(%)测序结果平均突变率(%)样品编号QC123.231.640.048.456.867.426.030.841.348.156.165.925.336.547.758.870.086.122.732.348.158.667.382.1level1level2level3level4QC2报告样单 5个药物、11个位点 基因型及耐药突变均定量报告 有利于发现优势、劣势耐药株 临床提供病程预测/用药指导 提供相关片段全基因量化信息（多分子

15、合作平台）ADV： 阿德福韦酯ETV： 恩替卡韦LVD： 拉米夫定LdT： 替比夫定TDF: 替诺福韦酯3/28/2018高通量测序检测的优势检出临床10071.18%72.86%合计54.77%HCV RNA 阳性指大于1000 IU/ml数字PCR在感染性疾病中的应用 细菌： 例如结核菌、耐药基因、MRSA 病毒： 例如HBV、HCV、 HIV、HPV PUBMed 有超过200 篇的应用研究（临床、环境卫生、复杂性状样本等）PMID2937860029378428KeywordHIVTitleDigital PCR as a tool to measure HIV persistence

16、.JournalRetrovirologyHuman gene therapy methodsYear2018 Jan 302018 Jan 29Virus Determination of Lentiviral Infectious Titer by a Novel Digital Droplet PCR Method.Biology of blood and marrow transplantation :journal of the American Society for29305193Virus Ultra-Sensitive Droplet Digital PCR for the

17、Assessment of Microchimerism in Cellular Therapies.An ultrasensitive electrochemical biosensor for the detection of mecA gene in methicillin-resistantMRSA Staphylococcus aureus.2018 Jan 2288102332908444129085077Biosensors & bioelectronicsAIDS research and human retrovirusesNature microbiology2018 Ja

18、n 152018 Jan2018 JanHIVThe Spleen Is an HIV-1 Sanctuary During Combined Antiretroviral Therapy.Virus Quantification of diverse virus populations in the environment using the polony method.Journal of veterinary diagnostic investigation :official publication of theDetection of Mycobacterium tuberculos

19、is-derived DNA in circulating cell-free DNA from a patient International journal of infectious diseases : IJID :2914829729154831Virus Detection of pseudorabies virus by duplex droplet digital PCR assay.2018 Jan2018 JanMTBwith disseminated infection using digital PCR.official publication of theTransc

20、riptome profiling of two maize inbreds with distinct responses to Gibberella ear rot disease29426290 Infection to identify candidate resistance genes.Phylogenetic analysis of porcine circovirus type 3 and porcine circovirus type 2 in China detectedVirus by duplex nanoparticle-assisted PCR.BMC genomi

21、csInfection, genetics and evolution : journal ofmolecular epidemiology and2018 Feb 92018 Feb 72018 Feb 12018 Feb2018 Feb29427762291421362911817629209860Size, Composition, and Evolution of HIV DNA Populations during Early Antiretroviral Therapy andIntensification with Maraviroc.Highly Sensitive Detection of Isoniazid Heteroresistance in Mycobacterium tuberculosis byDeepMelt