临床检验方法学评价

1、临床检验方法学评价山西医科大学第一医院检验科杨泽华新的临床项目开展通常需要进行一下工作：方法学性能的评价1.精密度评价：2.准确度评价：3.最低检测限4. 线性范围5.试剂的稳定性6.抗干扰性能7.参考区间诊断性能：1.灵敏度2.特异性一、定量检测方法的精密度评价临床上对病人标本测定时，通常只是测定一次就发报告，这就是在临床检验中为什么将方法、仪器或检测系统的精密度作为其性能的第一位的原因。现在一般推荐临床检测方法的批内SD应小于1/4TE，天间SD应小于1/3TE 。在实际使用过程中，一台仪器上可能进行许多项目的检测，决不能以一项检测的精密度评价结果代替所有项目的评价结果。美国临床实验室标准

2、委员会(NCCLS)，现更名为临床实验室标准研究院（CLSI），为临床定量测定方法精密度的评价出版了EP-5文件，该文件经多次修改，于1999年正式批准，2004年在次修改，发布为EP-5A2文件。不精密度分为批内不精密度、批间不精密度、天间不精密度、总不精密度。临床医师只关心总不精密度，而实验室工作人员便于分析问题，把总不精密度拆分为几项。精密度评价方案：试剂和校准品的选取标本的选取标本浓度的确定标本数量持续时间试剂和校准品的选取在整个评价过程中可以选取同一批号的试剂和校准品，但是这样会低估该实验室的精密度，最好使用使用不同批次的试剂和校准品，以更加客观地反映该实验室的精密度。评价标本的选取

3、应该选取与与临床标本具有相似性质的材料。如果可能的话最好选用稳定的冷冻保藏的混合血清。必要时也可以使用稳定的商品化的人血清基质质控品。标本浓度的确定通常推荐两个浓度的标本，当然也可以使用更多浓度的标本。在本方案中对两个不同浓度的标本分别进行评价。两个浓度值应尽可能跨越测量范围的大部分。如果使用两个浓度以上，另外的浓度值尽可能与实验室使用的医学决定水平相接近。如果想要与厂商说声明的精密度值做比较，那么就应该选取与厂商所采用的浓度接近的值。如果厂商要确立一个测定项目的精密度，应该选取高、低、接近医学决定水平的三个浓度分别进行评价。如果这三个浓度的精密度或者相对精密度一致，那么这三个浓度的结果就足以

4、说明问题。如果在这三个浓度处所获得的结果不一致或者有较大的差异，那么为了更加全面的反映方法的性能，就应该选取更多的浓度进行评价。标本数量为了正确地反映所评价方法的真实精密度，就需要足够的数据。每天应分析两批。如果因为质控或其他原因需要弃去一批测定，那么应该在找到原因并且在纠正错误之后重测一批。每个浓度的每批次测定应测定两次。每批都应进行质控品的测定以确定数据的可接受性。每批测定应改变标本和质控品的顺序。为了更好地反映实际操作情况，如果可能的话，每批测定至少包括10份病人标本。每天每批次之间的间隔时间至少为2小时。持续时间至少20天（不包括有离群值的测量日）本次讲座以血清ADA的测定为例来说明仪

5、器的熟悉阶段其中包括：仪器的操作、保养、标本的制备、试剂的配置、定标、仪器工作状态的监测等。仪器应在本实验室安装使用足够长的时间以熟悉各种问题的解决办法。对于决大多数仪器，5天时间就足够了。根据仪器的复杂程度以及操作者的技能，该时间可长可短。评价程序的熟悉由于评价实验中一些步骤在常规标本检测中并不碰到，为了避免这些步骤对精密度评价实验的干扰，在正式评价之前应实际进行一段时间的实验。这有助于对评价方案的熟悉。此步骤应进行到轻松地获取5天次的实验结果为止。在评价方案的熟悉阶段快要结束时，应进行精密度的初步评价。进行20次测定，理想情况下，进行两个或多个浓度的测定。仪器精密度的初步评价目的熟悉仪器的

6、操作初步判断仪器的性能确立离群值判断的界限如何进行在熟悉评价程序之后，对同一标本进行20次测定，最好进行两个浓度的标本的测定。计算SD和CV，如果与预期的差距较大，应与厂商联系，直到问题解决为止。初步评价结果二、利用病人标本进行方法学比对和偏倚的估计实验室准备用一个检测系统或测定方法进行测定标本前，应和原有检测系统或者公认的参考方法一起检测一批病人标本，对测定结果进行统计分析，用以估计新方法的偏倚，如果偏倚在允许范围内，说明使用新方法代替原有检测系统不会引入明显的偏倚，可以在临床使用。美国临床实验室标准研究院（CLSI），原来为NCCLS，致力于制定一系列评价临床方法的文件。CLSI是一个全球

7、性、多学科、非赢利性的标准化和教育性团体，旨在促进医疗卫生领域中的标准化进程和应用。CLSI的文件有以下三种形式：标准（Standard）指南（Guideline）报告（Report）多数CLSI文件可在2个水平上达成一致，即提议（Proposed），此类文件编号为P。批准（Approved），编号为A。根据评价或数据收集的需要，部分文件也可以介于上述两者之间，即暂定（tentative）。还有一类委员会报告，则是尚未通过一致化的文件，编号为R。目前CLSI公布的与方法学评价有关的文件主要有：EP（Evaluation protocol ）5-A 临床化学精密度评价批准指南。EP6-A 定量分

8、析方法的线性评价EP7-A 临床化学干扰实验EP9-A2 用患者标本进行方法学比较和偏倚评估EP10-A2 定量实验方法的初步评价EP14-A 基质效应的评价以BECKMAN DxC800和ROCHE MODULAR P模块HDL-C测定比对为例来说明。（一） 首先确立比较方法和实验方法以Roche生化分析系统作为比较方法（Comparative method） (X)，Beckman DxC800 作为实验方法（Test method）(Y)。（二） 标本的选取实验时间至少做5天，时间长一点更好；至少做40份标本（如每天至少做8份病人标本），多一点更好。尽可能使50%的实验标本分析物的含量在

9、参考区间外、可报告内，各个标本分析物含量越宽越好，进行双份测定，最后取平均值用于结果的计算。使用当天采集的标本，一份标本不够时可以将浓度相近的两份标本混合。（三 ）标本的测定整个实验必须有室内质量控制，失控时不能进行比对实验。比对标本最好在相同时间内进行测定，一般应在2小时内完成检测。标本按1、2、3、4、5、6、7、8顺序排列先测一遍，然后将顺序倒过来进行第二次检测。（四） 数据的上报和离群值的检验比对结果应以两种方式上报，一种为打印结果，另一种为Excel格式的电子版结果。方法内离群点的检验按以下公式分别计算每个标本用比较方法和实验方法两次重复测定的差值的绝对值，Xi=|xi1-xi2|Y

10、i=|yi1-yi2|这里i代表标本号，总共的标本数量为N。按以下方法计算上述绝对值的平均值，方法间离群值的检验（五）散点图的绘制（六 ）X数据范围是否足够宽的估计（七） 回归方程的计算（八） 计算偏倚的估计值及其相应的95%可信区间（九） 结果的解释三、临床检验项目检测限的建立 ：意义：一些项目的灵敏度对于临床具有重要的指导价值，比如肿瘤标志物、毒物、感染性疾病标志物、hsCRP、cTnI、TSH等，检测灵敏度是这些项目的重要性能指标。以TSH检测试剂盒的发展为例：第一代TSH检测试剂盒：为采用离心沉降技术的放免试剂，分析灵敏度为1-2mIU/L；由于灵敏度太低，对甲亢的诊断意义不大；第二代

11、TSH检测试剂盒：采用固相放射免疫技术，分析灵敏度为0.1-0.2mIU/L；由于具有较好的灵敏度，因此在甲亢的诊断中开始发挥作用；第三、四代TSH检测试剂盒；都使用了化学发光免疫技术，分析灵敏度分别可达0.01-0.02mIU/L和0.001-0.002mIU/L，比第一代试剂盒提高了2-3个数量级，使其成为甲亢诊断的首选指标。概念：空白限（limit of blank, LoB):空白样品杯观察到的最大检测结果。检出限（limit of detection, LoD):样品中分析物的最小量，可以在规定的可能性条件下予以检出，虽然也许还不能被量化为实际的值。定量限（limit of quan

12、titation,LoQ):样品中分析物的最小量，在规定的可接受精密度和正确度下被定量地确定。正确度（truness）：大量检测结果的均值和可接受参考值的一致性程度。正确度通常以偏倚表示。依据CLSI发布的EP17-A文件进行。基本步骤：1.确定LoB的程序至少进行60次空白测定，数据如果是正态分布，则LoB=X+1.645S;如数据为非正态分布，则LoB=Pct 。100-2.确定LoD的程序选择4到6个浓度为LoB1到4倍LoB的低浓度样本，至少获得60个重复测定结果。如果是正态分布，则LoD=LoB+CS；如果是非正态分布LoD=LoB+DS,3.确定LoQ的程序对3到5个不同样品至少作

13、5批，至少40次检测结果。实例：HBsAg检测限的确立1.空白限的确立(LoB)0.0030.0030.0070.0050.0030.0030.0030.0040.0060.0030.0030.0040.0040.0100.0050.0030.0050.0030.0040.0100.0050.0040.0040.0030.0050.0110.0030.0040.0030.0050.0050.0130.0040.0030.0050.0030.0050.0060.0040.0070.0040.0040.0050.0130.0070.0050.0030.0040.0040.0150.0030.005

14、0.0030.0040.0040.0080.0050.0050.0030.005第95百分位数应为95.5秩号的观察结果：LoB=（0.013+0.011)/2=0.0122.检出限(LoD)的建立：0.008 0.010 0.011 0.010 0.010 0.008 0.008 0.013 0.015 0.013 0.019 0.0130.019 0.019 0.019 0.016 0.022 0.015 0.018 0.015 0.024 0.018 0.018 0.0150.032 0.028 0.034 0.025 0.029 0.025 0.028 0.028 0.035 0.03

15、1 0.029 0.0280.032 0.036 0.039 0.040 0.042 0.045 0.038 0.038 0.036 0.042 0.040 0.0450.045 0.049 0.048 0.049 0.052 0.048 0.049 0.054 0.058 0.053 0.053 0.045LoD=LoB+DS,Ds,=中位数-第5百分位数的值=0.028-0.01=0.018LoD=0.018+0.012=0.0303.定量限(LoQ)的确立：预期样本浓度 样本数 XSBias CV（%） TE0.0120.0210.030121212028.615.410.757.245

16、.124.70.120.0030.180.0030.290.00314.33.30.0390.048121209.67.319.218.80.390.0040.500.0044.2TE=Bias+2CV四、线性范围的确立概念：线性范围：检测系统结果具有可接受线性的范围，即：非线性误差小于规定的误差。线性：提供的检测结果和检测样品中分析物浓度呈比例的能力。意义：对于病情观察和疗效评估具有重要意义。依据文件：EP-6A多项回归：y=a+b1x（一次多项式或线性拟合）y=a+b x+b x2(二次多项式）12y+=a+b x+b x2+b x3(三次多项式)123基本步骤：标本的制备检测数据处理结果

17、分析根据散点图对数据作出初步判断根据统计回归方程的标准误进行判断，其中标准误最小的回归方程为最好拟合使用t检验判断回归方程的非线性系数是否具有统计学意义判断每一个点的最佳回归的预测值和线性预测值的差值是否在允许范围内实例：ALT线性范围的确立表1 不同稀释度样本的配制方法1 2 3 4 5 678 9 10 11稀释度L加入量（l） 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0H加入量（l） 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200稀释度 第一次 第二次 平均值 差值差值百分数12345678944 44 44 0211 211

18、211 000376 377 376 -1 -0.266522 524 523 -2 -0.382699 696 697 3827 840 833 -13 -1.560994 994 994 00.43001165 1172 1168 -7 -0.5991292 1302 1297 -10 -0.77110 1438 1458 1448 -20 -1.38111 1571 1570 1570 1 0.064绘制测定值的散点图阶别系数符号系数值系数SEt检验自由度回归标准误1b0-90.382 7.682153.905 1.133-11.7652016.80012B1B0135.878-127.

19、0338.422-15.0831910.846223333B1B2B0B1B2B3170.821 3.22652.955-5.384-1.4100.262-108.46212.790-8.480 1817.61410.213155.481 8.8271.6521.6720.0920.988-0.170-1.851查t界值表，自由度为20、19、18的95%双侧t界值分别为2.086、2.093、2.101。测量均值一次多项预 三次多项预 线性偏 线性偏离百期值期值离分数21.145 48.0578.459 4.0094463.523217.428371.333525.238679.14342.

20、378208.969372.740533.691691.822211376523697-1.407 -0.374-8.453 -1.616-12.679-1.818-1.690-1.275833994833.048986.953847.133999.624-14.085-12.67111681297144815701140.8581294.7631448.6681602.5731149.2951296.1461440.1771581.388-8.437 -0.722-1.383 -0.1078.4910.58621.185 1.349阶别系数符 系数值 系数SE t检验 自由回归标准误号度1b

21、0-5.837-1812.08398.93316.95112B1B0156.04 0.9412165.888-8.232-179.899119.93314.568223B1B2B0166.54 3.438248.439-0.955 0.305-3.134-13.967-1610.178116.7838.361333B1B2B3163.74 10.469 15.6491-0.349 2.159-0.162-0.037 0.129-0.284查t界值表，自由度为18、17、16的95%双侧t界值分别为2.101、2.110、2.120。测量均值一次多项预 二次多项预 线性偏 线性偏离百期值期值离分数11.455 26.0343.820 1.8104457.10945.654211376523697833994116812971448213.151369.193525.235681.277837.319993.3611149.4031305.4451461.487209.331371.098530.955688.902844.939999.0661151.2831301.5901449.987-1.905 -0.506-5.720 -1.094-7