临床蛋白质组学last

1、硕士生学位课程：蛋白质组学第6讲 临床蛋白质组学 Clinical Proteomics检验医学院 周兰课程相关信息总学时数：36教学目的和要求： 1. 掌握蛋白质组学的基本概念 2. 熟悉蛋白质组研究的基本技术 3. 熟悉利用组学策略设计医学课题的基本思路 4. 培养开展临床蛋白组学研究的能力 人类基因组图谱只有一张，而蛋白质组图谱每个器官、每个器官的每一种细胞都有一张 而且在生理过程和疾病状态时还会发生相应改变发展的重点： *突破技术的瓶颈 *与“人类基因组”对接 *为解决人类健康与疾病问题做出更大的贡献 挑战：较基因组学更复杂和困难 本 讲 纲 要1. 临床蛋白质组学的内涵 定义，研究对

2、象，实验设计，研究内容 疾病蛋白质组学，研究特点，可用技术 2. 临床蛋白质组学的研究概况 大型的研究计划及其现状1 临床蛋白质组学的内涵1-1 定义 *将蛋白质组学技术应用于临床医学研究 *通过基础医学与临床医学的结合，阐明疾病发生发展的机制，探寻疾病预防、（早期）诊断、治疗和预后判断的标志物和靶标，以期在人类重要疾病的防治方面取得重大的突破 *恶性肿瘤是其中的重点研究对象是蛋白质组学的一个新的分支和十分重要的研究方向是运用功能蛋白组学策略的典型1 临床蛋白质组学的内涵Clinical proteomics is the application of proteomics technique

3、s in the medical field. Its main aim is to identify proteins involved in pathological processes and to understand how illness can lead to altered protein expression. It offers the opportunity and the potential to develop new diagnostic and prognostic tests, to identify new therapeutic targets, and e

4、ventually to allow the design of individualized patient treatment. 1 临床蛋白质组学的内涵1-2 研究对象：直接来自临床 手术取材或活检组织 血液及其不同组分 其余体液 脑脊液、唾液、尿液、支气管肺泡 灌洗液、泪液、精液、膝关节滑液 胆汁、乳头抽吸液、羊膜穿刺液等 福尔马林固定-石蜡包埋的组织* （formalin fixed paraffin embedded，FFPE）FFPE从FFPE样品中获得生物分子（DNA、RNA和蛋白质等） 将为科学家们打开通往疾病研究路途上一个 藏有更多数据的宝库大门近年，以FFPE组织为研究对

5、象的蛋白质组学打破了以新鲜组织标本为研究对象的传统模式，其优势： *丰富的标本库存 *完善的临床资料 *“原生态”* 如何实现的?世界上大约有数十亿份组织样品保存在医院或者组织样品库中绝大多数是 FFPE有效提取全长蛋白用于定量分析的试剂盒（QIAGEN） Qproteome FFPE Tissue Kit Qproteome 2D FFPE Tissue Kit 例如：肿瘤组织与正常组织的差异表达研究 * FFPE组织蛋白质组学技术的成功建立 极大地加速了临床蛋白质组学的研究石蜡包埋组织与冷冻组织2D-LC MS/MS鉴定蛋白的比较QIAGEN（快而精公司 ） * 1984年，QIAGEN在

6、德国成立 * 是一家专业化致力于生物分子样品制备解决方案的跨国经营企业，总部位于德国 *QIAGEN产品的卓越品质和在应用中的出色表现使得其成为样品处理中标准的代名词 还不断有新的探索和研究 No best, only better.The HKUPP will provide guidelines or standard procedures for non-proteiuric urine proteomics; procedures for collection and storage of urine samples, and for preparation and separatio

7、n of protein from the samples. The draft will be released in 2008.1 临床蛋白质组学的内涵1-3 实验设计Healthy / DiseasedCancerous / BenignDrug resistant / Drug susceptibleTreated / Untreated 1-4 研究内容1）以临床样本研究疾病发生发展机制(如信号转导通路等）2）从临床样本中发现和确认生物标志物3）寻找新的治疗药物靶点4）以组学的研究思路开展个体化治疗方案的研究5）将组学技术用于新药研发过程（指导新药筛选、优化以及药物的临床前研究）6）

8、将组学技术用于药物的临床评价（疗效评价、药物毒性及药效学）7）提高临床样品的收集、贮存等的质量8）建立适用于临床实验研究的新技术(蛋白芯片、生物质谱等)）9）开发相关生物信息学工具1-5 疾病蛋白质组学应用蛋白质组学技术，比较正常和病理条件下的细胞、组织或体液中蛋白质的变化（成分、水平、定位、修饰等），揭示疾病过程中全部蛋白的活动规律，以阐明疾病发生发展机制，发现可用于疾病早期诊断和预后判断的特异蛋白和治疗的药物靶标强调：各种具体疾病的蛋白质组学 如肿瘤蛋白质组学、肝病蛋白质组学即：狭义的临床蛋白质组学1 临床蛋白质组学的内涵1-6 特点1）蛋白质数量巨大2）蛋白质含量的动力学范围很宽3）临床

9、蛋白质组学对检测灵敏度的要求很高4) 实时、原位检测更有意义5) 对蛋白质相互作用的检测是其重要内容6) 临床样本的处理是分析的瓶颈1) 蛋白质数量巨大Proteome of a cell：5x103 ProteinsProteome of a cell(all life)：1.5x104Proteome of an individual：1x106Proteome of an individual(all life)：1x107Proteome of a specie：1x108 建立分辨率更高的分离技术平台是必须的2) 蛋白质含量的动力学范围很宽细胞内表达蛋白的动力学范围为106血浆中蛋白

10、的动力学范围高达109-12 2) 蛋白质含量的动力学范围很宽Copy number of protein in one cellHigh expression： 105 106Moderate expression：103 104Low expression： 101 - 102重量单位及其换算 kg gmgg（微克） ng（毫微克，纳克） pg（微微克，皮克，10-12g） fg（毫微微克，飞克， 10-15g) ag(微微微克，阿克，10-18g）血浆蛋白的特点1）不同血浆蛋白含量差异很大 高丰度（High-abundance protein）： mg/ml 中丰度：mg/ml 低丰度：

11、ng/ml 极低丰度： pg/ml2）高和中丰度蛋白质占血浆总蛋白的99% （其中21种占90%以上） 而上万的低和极低丰度蛋白 1000ml *在人类，无论肿瘤或其它病变破坏肝脏，但只要这些占位性病变不压迫汇管区，只要尚存300克以上的健康肝组织，患者饮食方面仍无明显症状，肝功也无太大障碍 *经手术切除肝脏75%，恢复原状： 鼠需要周，狗需周 人类则需个月 肝脏具有其它器官无法比拟的旺盛的再生和修复能力 全球及中国肝炎、肝癌的流行病学统计&肝炎全球有20亿人感染肝炎病毒全球慢性乙型肝炎和丙型肝炎患者大约有5亿人（占世界人口的1/12）近80%的肝癌病例由乙肝、丙肝病毒引起144万人死于病毒性

12、肝炎（2010年）&原发性肝癌全球每年100万新发，其中40-50%在中国近20年来我国肝癌发病率上升近40%起病隐匿，初诊已中晚期初诊病人中，15-20%的病人具备手术条件术后的5年生存率低很难单从几个基因和几种蛋白质来解决肝脏疾病问题从蛋白质层面“全景式”揭示肝脏疾病的生理病理机制是解决重大肝病的根本出路 SO，肝脏是HPP的首批目标人类肝脏蛋白质组学计划（其总部在北京）（Human Liver Proteome Project，HUPO HLPP） 2003-11，在蒙特利尔召开的第二届国际蛋白质组大会，确定中国为HLPP牵头国，贺福初为主席，中国科学家承担30的研究任务，成为推进该计划

13、的主力军团（HGP：1） HLPP一提出就引起全球蛋白质组学领域科学家的高度关注，参与该研究项目的国家有中国、美国、法国、加拿大等18个国家和地区的100多家实验室贺福初 院士http:/pages/main.jsf HLPP的主要研究内容 比较分析健康和疾病状态下人类的蛋白质组，阐明其完整的表达模式确定肝脏蛋白质组的亚细胞定位和亚细胞蛋白质组的轮廓对肝脏蛋白质组的蛋白质间相互作用及其联系网络进行全面分析，建立肝脏蛋白质组联系网络图（肝脏蛋白质组的相互作用组）4) 全面分析肝脏蛋白质组的PTM，阐明其蛋白质修饰模式5) 建立HLPP与HPPP的联系，平行比较来自两个计划的资源、技术和数据，以发

14、现新的生物标志物6) 将人类肝脏蛋白质组的研究成果与肝脏转录组、人类基因组的结果进行关联和整合，构建数据库 HLPP的科学目标揭示并确认肝脏的蛋白质在蛋白质水平上规模化注解与验证HGP所预测的编码基因，实现肝脏转录组、蛋白质组、血浆蛋白质组及人类基因组的对接与整合，揭示人类转录、翻译水平的整体、集群调控规律建立肝脏“生理组”、“病理组”，为重大肝病防、诊、治疗和新药研发的突破提供重要的科学基础最终：发现一批肝脏疾病的预警分子、诊断标志、药物靶标和创新药物，为提升肝病预防、诊断与治疗水平，提供强劲的科学动力 HLPP Workshop等相关会议 HLPP WorkshopReport of th

15、e 9th HLPP Workshop October 2007, Seoul, Korea.The 2009 Human Liver Proteome Project (HLPP) Workshop 26 September 2009, Toronto, Canada.The 12(th) Human Liver Proteome Project (HLPP) Workshop September 2010, Sydney, Australia.The 2011 Human Liver Proteome Project (HLPP) Workshop September 5, 2011, G

16、eneva, Switzerland. 首次报道人肝脏蛋白质组大规模数据 /proteome_sky/0910/09.10.12.jpr.html 2009年，人类肝脏蛋白质组计划（HLPP）的研究人员在 JPR（DOI10.1021/pr900532r）上发表人类肝脏蛋白质组的一期研究结果，文章共鉴定了6788个高可信度的中国成人肝脏蛋白质，是迄今最大规模的人体器官蛋白质组数据集目前，表达谱数据及相应的分析结果已分别整合成两个数据集，通过网站发布： dbLEP（http:/）Liverbase（http:/）http:/ HLPP完成情况 历经10余年的努力，以贺福初为代表的中国蛋白质组研究

17、团队，在该领域向世界交了一份漂亮答卷：1）成功构建迄今国际上质量最高、规模最大的人类第一个器官（肝脏）蛋白质组的表达谱（其中三分之二的蛋白都属于从未发现过的新蛋白)、修饰谱、连锁图及其综合数据库2）首次实现人类组织与器官转录组与蛋白质组的全面对接3）“九大行星” 表达谱和修饰谱（两谱） 定位图和连锁图 生理组与病理组 样本库、抗体库和数据库（三库） 具体完成内容*鉴定人肝脏蛋白质13000余种；*系统建立人类首个人体器官蛋白质组数据库；*发现了包含1000余个“蛋白质-蛋白质”相互作用的网络图；*建立了2000余株蛋白质抗体 *完成了人正常肝肝炎肝硬化肝癌的比较蛋白质组学研究*完成了肝癌转移相

18、关的比较蛋白质组学研究*通过疾病蛋白质组学的研究，发现了30个以上可能具有对肝癌进行预警、诊断和预后判断的分子标记物，为进一步确认靶标和关键蛋白质奠定了基础*构建世界第一张人类器官蛋白质组“全息图”，对国际蛋白质组学研究与HPP均具有里程碑意义 *已确定6788个高可信度的中国成人肝脏蛋白质 因此，在第八届国际蛋白质组学大会(2009)上贺福初院士荣获“成就奖“ 国际蛋白质组学大会被誉为“蛋白质组学的嘎纳节”6788个高可信度的中国成人肝脏蛋白质 http:/dblep/main.jsf1000余个“蛋白质-蛋白质”相互作用的网络图 “中国人类肝脏蛋白质组计划”2004年底：该计划正式启动“8

19、63”计划、“973”项目、重大国际合作项目等的联合资助，资金8000万元“三大计划”联合资助同一项目，在我国科技项目管理上史无前例实践证明，该资助模式为快速大力启动重大科研项目提供了保证，确保了中国在HLPP这一国际合作项目中的领导地位 HLPP对我国的意义中国肝炎病毒携带者几乎占世界一半每年死于病毒性肝炎、肝硬化和肝癌的人数占世界的一半每年的医疗费用超过千亿元（约占国民生产总值的1%） HLPP的实施，旨在最终发现一批肝脏疾病的预警分子、诊断标志、药物靶标和创新药物，为提高乃至突破现有的肝脏疾病诊断和防治水平提供科学依据 进展：Proteomics.2010 Sep;10(17):3058

20、-61. doi: 10.1002/pmic.201090074.The 2009 Human Liver Proteome Project (HLPP) Workshop 26 September 2009, Toronto, Canada.Gao X1,Zheng J,Beretta L,Mato J,He F.Author informationAbstractThe Human Liver Proteome Project (HLPP) was formally launched by HUPO in 2002. The 11th HLPP Workshop was held on S

21、eptember 26th, 2009 during the 8th HUPO World Congress in Toronto, Canada. The representative progresses were presented from four groups. Subsequently, the workshop ended with a lively discussion on four topics related to the project as well as other initiatives.PMID:20806223PubMed - indexed for MED

22、LINE进展Proteomics.2011 Apr 18. doi: 10.1002/pmic.201100136. Epub ahead of printThe 12(th) Human Liver Proteome Project (HLPP) Workshop September 2010, Sydney, Australia.He F.Author informationAbstractThe 12(th) HLPP workshop was held in conjunction with the 9(th) HUPO 2010 World Congress on September

23、 20(th) in Sydney, Australia. This 2-hour workshop was chaired by Prof. Fuchu He (Beijing Proteome Research Center, BPRC). Highlights included: 1) progress of the post-translational modification of liver proteome; 2) construction of the human liver protein interaction and localization maps; 3) progr

24、ess made in terms of identifying biomarker for liver diseases; and 4) discussion on the second phase of the initiative. This was followed by a lively discussion related to the project.Copyright 2011 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim.PMID:21751379PubMed - as supplied by publisher进展：Proteomic

25、s.2012 Jan;12(1):5-8. doi: 10.1002/pmic.201100555. Epub 2011 Nov 29.The 2011 Human Liver Proteome Project (HLPP) Workshop September 5, 2011, Geneva, Switzerland.Elortza F1,Beretta L,Zhang X,He F,Mato JM.Author informationAbstractDuring the 10th HUPO Annual World Congress held in Geneva (Switzerland)

26、 from 4th to 7th September, a workshop on Human Liver Proteome Project (HLPP) Initiative took place. Four research groups presented their latest results from different ongoing projects. Later on, during the HLPP executive members meeting, the status of current projects and the next possible steps to

27、 be taken were discussed.Copyright 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim.PMID:22106089PubMed - indexed for MEDLINEScreening of Missing Proteins in the Human Liver Proteome by Improved MRM-Approach-Based Targeted Proteomics更好的技术， 更多的发现Department of Chemistry,Fudan University, Shanghai 20003

28、2,P. R. ChinaInstitutes of Biomedical Sciences,Fudan University, Shanghai 200433,P. R. ChinaJ. Proteome Res.,2014,13(4), pp 19691978DOI:10.1021/pr4010986To completely annotate（注释） the human genome, the task of identifying and characterizing proteins that currently lack mass spectrometry (MS) evidenc

29、e is inevitable and urgent. In this study, as the first effort to screen missing proteins in large scale, we developed an approach based on SDSfollowed by liquid chromatographymultiple reaction monitoring (LC-MRM), for screening of those missing proteins with only a single peptide hit in the previou

30、s liver proteome data set. In total, the expressions of 57 target proteins were confirmed from 185 MRM assays in normal human liver tissues. Among the proved 57 one-hit wonders, 50 proteins are of the minimally redundant set in the PeptideAtlas database, 7 proteins even have none MS-based informatio

31、n previously in various biological processes. We conclude that our SDSMRM workflow can be a powerful approach to screen missing or poorly characterized proteins in different samples and to provide their quantity if detected. The MRM raw data have been uploaded to ISB/SRM Atlas/PASSEL (PXD000648).Hum

32、an Plasma Proteome Project (HPPP) 肝脏作为最大的分泌器官，合成大多数的血浆蛋白 两者关系密切 HPPP的主要研究目标 *全面分析人类血浆和血清蛋白成分*确定不同人种血浆蛋白质的差异程度*通过生物标记方法，确定不同时期和不同条件下的血浆蛋白质组的改变 包括生理（如年龄、性别、经期）、劳动作业和病理状态（如特定疾病）以及一般药物治疗引起的变化 HUPO HPPP（http:/hupo/hppp/）HUPO HPPP（/hupo/hppp/）该计划启动阶段：要求所有参加实验室均使用相同的 “参考样品”(reference specimens)该参考样本分别由英国、美

33、国和中国按照同一标准提供，制备成不同人群的混合血浆（EDTA、肝素和构椽酸钠抗凝血）和血清 代表世界上主要人种的参考样本取自志愿者 志愿者分别属于白种美国人（Caucasian-American）、非洲裔美国人（African-American）、亚裔美国人（Asian-American）和亚裔中国人（Asian-Chinese）在此基础上使用各Lab不同的技术平台、不同的蛋白质组学实验方案，全面鉴定和分析正常人血浆/血清蛋白质组建立人类血浆蛋白质数据库 Recent workshops of the HUPO human plasma proteome project (HPPP): A b

34、ridge with the HUPO cardiovascular initiative and the emergence of SRM targeted proteomics. Proteomics 11:34393443. Omenn, G.S., Baker, M.S., and Aebersold, R. 2011 Proteomics Standards Initiative（PSI）临床蛋白质组学的分析结果受多种因素影响 1）分析前 2）分析中 3）生物学差异 Chair: Henning Hermjakob(UK)临床蛋白质组学研究的干扰来源 (1) 分析前的误差：是样本处理

35、过程中所产生的差异 如：样本在收集、储存等过程中由于条件不同而引入的差异(2) 分析中的差异：是指在研究过程中所产生的差异 仪器设备本身在准确度和精密度方面存在的问题而带入的实验误差或偏差；技术操作不当所带来的差异；在进行生物信息学搜索时，因原始实验数据使用不当，或搜索参数的设置不当所带来的误差或偏差生物学的差异：包括个体间差异和个体内差异由于其对象是临床标本，固有的个体的异质性（inherent individual heterogeneity）为研究工作带来更大的困难 *个体间差异：指来源于年龄、性别和人种等所造成的差异 *个体内差异：指个体在不同时间、不同生理状态（如月经周期、禁食与否）

36、或不同病理状态下（如疾病的不同发展阶段、治疗前后）所出现的差异。 其中，某些差异与疾病没有直接关系，但确实增加了寻找疾病相关差异蛋白的复杂性，并有可能影响蛋白质组分析的结果。 例如：按照通常标准所选择的两个健康个体所获得的样本，即使是在同一时间按照完全相同的技术进行测定，也会发现其蛋白质的表达丰度有明显的差别。这种异质性可能来源于遗传，也可能与环境因素有关。有关临床蛋白质组学研究中的标准化工作 为了规范临床蛋白质组学的研究行为，2002年人类蛋白质组组织(HUPO)专门成立了一个蛋白质组学标准化工作委员会（HUPO Proteomics Standards Initiative，PSI）来研究

37、和解决某些重大问题 关注点： (1) 根据不同样本的特点,精心设计样本收集、贮存和处理的实验过程(2) 有足够多的样本收集来源（尽量多的疾病亚型），以充分反映疾病的整体情况(3) 仔细考虑各个蛋白质组研究技术的优势和缺陷，建立最能反映真实情况的技术策略，并尽可能采用自动化装置，以减少实验误差(4) 采用正确的统计学方法(5) 不要单凭一组样本的实验数据就做出肯定的结论，最好对样本群(sample cohos)进行合理分配，以多中心验证程序(multicenter validation process)进行工作，并相互验证(6) 可能永远不会有一种生物标志物会百分之百地出现在一种疾病的所有个体患

38、者之中；能在一类患者群体中找到某一种标志性分子以较高的几率出现，那已经是一项了不起的成就了HUPO-PSI workshopFrom proteomics data representation to public data flow: a report on the HUPO-PSI workshop September 2011, Geneva, Switzerland.Ten years of standardizing proteomic data: a report on the HUPO-PSI Spring Workshop: April 12-14th, 2012, San D

39、iego, USA.Preparing to work with big data in proteomics - a report on the HUPO-PSI Spring Workshop: April 15-17, 2013, Liverpool, UK.Meeting New Challenges: The 2014 HUPO-PSI/COSMOS Workshop: 13-15 April 2014, Frankfurt, Germany. 总结：临床蛋白质组学是蛋白质组学最重要的拓展方向和最重要应用领域之一具有广阔的应用前景而倍受临床医疗、科研机构和药品研究与发展部门的关注除了具有蛋白质组学自身的特点外，还具有突出的“临床”特色，它的研究对象是临床患者或者围绕临床工作的动物模型、细胞模型，其研究成果与临床诊断学和临床治疗学有密切关系其研究思想和工作模式既不同于经典的临床研究工作，也不同于基础医学研究工作，而是需要在系统生物学思想的指导下进行全新的实践和探索 人类蛋白质