分子生物学实验思考题李明

1、摸索题 1. 在基因组 DNA提取过程中应留意哪些问题？1）EB一种诱变剂,操作时肯定要留意安全操作,必需戴塑料或乳胶手套；2 点样的时候要特殊当心,留意不要把点样孔底部给刺穿,也要留意防止样品扩散 到别的点样孔中去；3）每取完一种试剂,必需换枪头,防止造成污染；4）留意电极方向不要弄反；5）操作是动作要轻柔,防止液体内以及液体与容器间产生的剪切力；6）混合不同的液体时切忌震荡,甚至要静置；7）之一各试剂的添加次序；2. 在电场中,带负电荷的DNA向阳极迁移,该过程受哪些因素的影响1）、 DNA的分子大小 : 线状双链 DNA分子在肯定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与 DNA分子量对数成反比,分子

2、越大就所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢；2）、 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状 DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同；DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系；凝胶浓度的选择取决于 DNA分子的大小；分别小于 0.5kb 的 DNA片段所需胶浓度是 1.2-1.5%, 分别大于 10kb 的 DNA分子所需胶浓度为 0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间就所需胶浓度为 0.8-1.0% ；3）、 DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时 , 它在电场中移动距离不仅和分子量有关 , 仍和它本身构象有关；相同分子量的线状、开环和超螺旋 DNA在

3、琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的 ,超螺旋 DNA移动最快 , 而线状双链 DNA移动最慢；如在电泳鉴定质粒纯度时发觉凝胶上有数条 DNA带难以确定是质粒 DNA不同构象引起仍是由于含有其他 DNA引起时 ,可从琼脂糖凝胶上将 DNA带逐个回收 , 用同一种限制性内切酶分别水解 , 然后电泳 ,如在凝胶上显现相同的 DNA图谱 , 就为同一种 DNA；4）、 电源电压 在低电压时 , 线状 DNA片段的迁移速率与所加电压成正比；但是随着电场强度的增加,不同分子量的 DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长, 片段越大 , 因场强上升引起的迁移率上升幅度也越大 , 因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分别范

4、畴将缩小；要使大于 2kb 的 DNA片段的辨论率达到最大 , 所加电压不得超过 5v/cm；5）、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的 DNA,染料会嵌入到积累的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状 率降低 15；6）、 离子强度影响DNA,使其刚性更强 , 仍会使线状 DNA迁移 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA的电泳迁移率；在没有离子存在时 如误用蒸馏水配制凝胶 , 电导率最小 ,DNA几乎不移动 , 在高离子强度的缓冲液中 如误加 10 电泳缓冲液 , 就电导很高并明显产热, 严峻时会引起凝胶熔化或 DNA变性；对于自然的双链 DNA,常用的几种电泳缓冲液有 T

5、AE 3. 假如提取的 DNA产量较低,分析缘由并提出解决方法- 70低温1）样本材料老化或反复动容导致DNA含量下降；解决：应选择新奇的材料样品,不能准时处理的样品应立刻放入液氮或储存,以防止 DNA降解；样品破壁或裂解不完全,DNA未充分释放；解决：动植物材料应在液氮中充分研磨匀浆,应用溶菌酶、 Lyticase 酶或机械帮助破壁；样品过多导致细胞裂解不充分G 细菌就、酵母等破壁较困难的样品解决：不同来源样品依据查阅资料,加量不同；DNA吸附不充分解决：如在上吸附柱前未加入无水乙醇,或用低浓度乙醇代替无水乙醇,就导致 DNA不能充分沉淀,与硅胶膜吸附不完全,因此在样品裂解后加适量无水乙醇,

6、在 加上吸附柱使 DNA与硅胶模充分吸附；DNA洗脱不当解决：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍 DNA从硅胶模上洗脱下来,应确保洗脱液pH在7.08.5 之间；习题：如 PCR反应后琼脂糖凝胶电泳检测发觉有多条扩增片段,如何获得单一、纯度高的目的基因片段,以保证后续试验的进行；简述方法及原理 DEAE-纤维素膜电泳法 透析袋电洗脱法低熔点琼脂糖凝胶法 凝胶冻融法滤纸法挖孔法DEAE-纤维素膜电泳法 原理：醋酸纤维素薄膜电泳仪醋酸纤维薄膜为支持物,他是纤维素的醋酸酯,由纤维素的羟基经乙酰化而制成；它溶于丙酮酸等有机溶液中,既可以涂布成为一系咪的微孔薄膜,厚度为 0.1mm0.15mm为宜；太厚吸水性差

7、,分别成效不好；太薄就 膜片缺少应有的机械强度就易碎；透析袋电洗脱法原理：将含有 DNA片段的凝胶切下置于布满1xTAE的透析袋中,使凝胶块沉下,去掉大部分缓冲液,在凝胶上方加紧透析袋,不留气泡,将透析袋浸泡在 1xTAE电泳槽中,电泳 2 至 3 小时,使 DNA从凝胶中洗脱下来；从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA 30左右成胶,大约在65熔化,在大原理：琼脂糖的糖链上引入了羟乙基,在多数双链 DNA熔点温度下；试验六感受态细胞的制备摸索题感受态细胞的概念及作用？概念： 将外源 DNA分子引入受体细胞一传递遗传信息的过程称为转化；作为重组DNA分子转化的受体细胞,在经过一些特殊方法（如 CaCl

8、2、电击法等）处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能接受外源 DNA分子通过的细胞称为感受态细胞；作用：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达,不仅可以检验重组载体是否构建胜利,最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续试验,如蛋白质表达纯化等工作；如转化率较低,分析其缘由？可能是转化态细胞制得不够多,所以转化并胜利导入菌体的目的基因个数比较少；也有可能是由于 DNA的连接不好,就是DNA未胜利连接在菌体DNA上；连接缓冲液活性低, ATP降解或缓冲液稀释不当；连接酶失活 PCR产物中含有抑制连接的成分,导致连接失败；PCR产物没有 3A突出端,不能连接 载体 T 突出端丢失,引起载体平端连接 插入片段与载体比例不抱负污染 转染过程中,反应条件掌握不当；3. 进行重组子选择和鉴定时,如菌落PCR