青霉素发酵实操过程15摇瓶菌种制备

1、附件：课程教案2016 - 2017 学年第2学期课程编号 33549课程名称青霉素发酯生产技术授课教师韩文清学院名称食品药品工程学院课程授课教案教学单位生物制药专业（方 向）名称生物制药学习情境1.青霉素发酵预备知识及菌 种扩培子学习情 境1.5摇瓶种制作及培养授课题目摇瓶种制作及培养学时：6授课学期2016-2017 N授课进度第 次课教学目标掌握三角瓶内液体培养基的接种方法，掌握液力 培养及观察。K摇瓶的培养条件，作好动态教学重点（1）液体培养基制备（2）液体摇瓶的接种方法教学难点（1）液体培养基制备（2）液体摇瓶的接种方法教学方法讲授法、演示法、小组讨论法。教学手段多媒体、教学视频。材

2、料与工具多媒体设备、火菌锅、显微镜、超净工作台等教学步骤设计步骤时间主要任务教师活动学生活动第一步（5分钟）实训内容介绍教师发放任务单，明 确学习任务，并进行 讲解。学生听取老师的讲解， 分析工作任务单要求。第二步（5分钟）材料准备（以小组为单位）做好指导学生操作第三步 （40分钟）液体培养基制备教师讲解学生观察练习第四步（80分钟）大米抱子计数检查巡回指导分组操作第五步（10分钟）接种工具及材料准备巡回指导分组操作第六步（30分钟）紫外照射加水示范指导单独练习第七步 （10分钟池子悬浮液制备教师示范分组操作第八步 （20分钟）倒入悬液、上下振摇教师示范轮流监控、压力准确第九步（50分钟摇床动

3、态观察培养巡回指导记时准确、书写报告报 告具体教学过程（含讲解内容）教学组织一、分组学生全部进入发酵室后，将其分为7组，各组组长兼任安全员、副组长兼 任设备材料员，达到学生的自管自治和相互监督，学生与教师的高度配合。二、工作过程导入（资讯）教师通过ppt向学生展示青霉菌液体摇瓶培养物，提出问题：大家想，由试管到茄子瓶培养物、再到液体摇瓶培养有什么变化？学生回答，引导学生：容器大小？菌丝形态？产黄青霉生长数量？投入生产后生长扩增 速度及进入合成代谢所需时间？最后得出结论。在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。菌丝体比抱子要有利：1、缩短发酵时间（产黄青霉深层发酵一般仅需2-7d就可获

4、得大量的菌丝体， 而固体培养则需30-60do）2、有利于获得好的发酵结果霉菌：生长较慢，如青霉菌，一般采用三级发酵抱子悬浮液一一级种子罐（27七,40、时抱子发芽，产生菌丝，50-100L ） 一 二级种子罐（27七,1024、时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体， 500-1000L） 一发 酵罐继续引导学生思考：我们在实验室自己如何能获得青霉菌液体摇瓶培养物？附1:摇瓶种制作的原理产黄青霉摇瓶种制作是在发酵罐中，采用液体培养基通入无菌空气并加以搅 拌，增加培养基中溶氧含量，提供产黄青霉菌体呼吸代谢所需要的氧气， 并控制 适宜的外界条件，获得大量的菌丝体或代谢产物。为何用三角瓶？通气问题怎么解决？

5、装液量多少？液体培养基如何制作，接种量多少（还用抱子悬液吗）？通过抱子计数来获得一粒大米的抱子数量，然后称量大米的克数及相应米粒 数量，来推知其整体所含抱子数，来确定单位体积培养液的接种量（1粒米含1.4X 106个抱子，接种量为200亿抱子/吨）。得到的培养物能否检测其生长量？（答案是肯定的）一般用菌体浓度来反映培养液里菌丝生长量，通过溶液比浊度或单位体积菌 丝体干重的测定来反映菌体浓度。三、教学任务导入（资讯）要求学生快速浏览青霉素发酵学习指导书上的参考资料， 并提炼出液体摇瓶 种培养制备的关键技术点，从而让学生建立对该工作过程的感性认识。接着教师 随机指定学生回答问题：液体摇瓶种培养制备

6、在青霉素发酵生产流程中的作用是什么？从而引出本次课要完成的任务。附2:摇瓶种子制备主要操作步骤：称量一煮制一分装一火菌一无菌检验一接种一振荡培养管理附3:液体种（三角瓶）制作的主要参数：1）培养基营养成分含量应较斜面丰富，以确保一定的营养菌体生长量；能保 持生长过程中pH稳定。2）培养基装量适当，以保证良好的通气并与发酵罐通气条件相适应；参考装 量为 40-50 ml/ 250 ml 瓶,60-80 ml/ 500 ml 瓶，90-110 ml/ 750 ml 瓶，120-150 ml/ 1000 ml瓶；如果是厌氧培养，则装量应增加一倍以上；3）灭菌时要注意不要让蒸汽冷凝水打湿或粘污培养基在

7、瓶塞或纱布上4）注意摇床转速，转速越快，偏心距越大，通气越好。经常检查，皮带松 弛时要紧一紧。5）注意摇床中心与边缘、上层与下层的温差引导学生分析液体摇瓶种培养制备的详细步骤，找出关键技术点，导出工作过程：由大米培养基（三角瓶或茄子瓶）培养物到液体摇瓶种的菌种扩增制备流 程。四、任务实施.初步方案讨论（计划）以小组为单位，按照发酵实训任务书上的“任务 1.5、产黄青霉制备及培 养”的学习目标及任务要求，查阅学习指导书上的相应参考资料，通过学习， 各小组分别讨论产黄青霉菌株的液体培养基制备、灭菌、接种、振荡培养及菌体 浓度测定、填写项目任务书。.最佳方案筛选（决策）教师对各小组方案进行点评，推荐

8、最佳方案，进行修改完善，并对其它小组 的方案进行指导，找出错误或不足之处。同时，学生填写项目任务书。.方案具体实施各小组按照产黄青霉菌株大米抱子制备制备流程的定稿方案，利用实验室的器材，具体实施：称量一煮制一分装一灭菌一无菌检验一接种一振荡培养管理， 最后进行菌体浓度测定，制作自己青霉素发酵实训动漫演示作业。仔细观察实训生产的过程，对每一步都进行记录，最后完成小组用书的项目 记录表。注意：亲米接种后或亲米接入生产米后要经过激烈振荡混匀才可放置包 温培养；生产米要求每粒米的抱子量达到 300万个以上。亲米、生产米抱子保存在 5 C冰箱内。.关键能力的重点指导（检查）教师对学生的实践练习进行有效监

9、控，巡回指导，及时指出不规范的操作。 并对其关键能力进行重点指导。如培养基制备、灭菌、接种、振荡培养及菌体浓 度测定等。.任务结果评价完成产黄青霉菌株的大米抱子制备任务后，各小组分别展示产黄青霉菌株的 大米抱子三角瓶培养物。首先，进行组内自我评价和组问互评，接着，教师对每 组结果进行评价，指出存在的问题和改进的方法。（附：评价项目包括：产黄青霉菌株培养物无杂菌污染、产黄青霉菌株在液 体培养的生长指标、镜下能观察到典型的产黄青霉菌丝体。 实际生产中每批抱子 必需进行严格摇瓶试验，测定效价及检查杂菌情况。）.任务小结各组讨论进行项目小结、填写项目报告书。教师指出各小组在操作过程中存 在的问题和正确的处理方法，评价同学们在任务实施过程中的表现 （包括遵守纪 律，认真仔细，团结合作），提出表扬，指出不足。.完成课后作业要求学生完成发酵实训任务书中该环节中的相关作业题。.布置下一任务发酵系统学习与认识、发酵罐温控（水循环）操作。作业或课后任务1、通过实训后完善本任务的实施方案。2、请组长带领组员完