HCV复制子复制效率的影响因素及意义

1、HCV复制子复制效率的影响因素及意义【关键词】,肝炎病毒【关键词】肝炎病毒,丙型；复制子；变异(遗传学)；细胞容受性0引言自1989年丙型肝炎病毒hepatitisvirus，HV发现以来，HV体外细胞模型研究一直是HV研究的热点问题之一，能在人肝癌细胞系中高程度自主复制的HV复制子系统的出现，大大加强了HV体外复制机制的研究.至1999年复制子模型系统被首次描绘以来，这个系统逐步得到了完善.特别是细胞培养适应性变异及宿主细胞容受性这两个能明显增强HV体外复制才能的重要因素的发现，拓展了复制子系统的应用领域，如瞬时复制系统、选择性全长基因组及根底研究和抗病毒药物挑选所需各种新型复制子的构建.最

2、终，复制子系统将有助于诠释干扰素抗性的分子根底.我们就复制子的适应性变异和细胞容受性问题进展综述.1细胞培养适应性变异1.1细胞培养适应性变异区域适应性变异现象1-2最初是通过在G418挑选的细胞克隆内复制的HVRNA序列分析而发现的，在多种情况下，发现一个特定细胞内复制的复制子RNA分子群体内，HV编码区至少可见一个位点变异，致一个氨基酸替代，而该氨基酸的替代在这个细胞克隆中所有RNA分子间是很保守的，尽管每一个HV非构造蛋白都可见这种“保守性变异，它们集中于某些特定的区域.主要集中区域位于NS5A丝氨酸该蛋白高度磷酸化所需氨基酸富集的中心区域，研究显示该区域丝氨酸残基常被替代S2197，S

3、2201，S22043，而NS5A高度磷酸化在控制HVRNA复制过程中起着关键的作用4，但迄今尚不清楚NS5A磷酸化的改变如何影响RNA复制.第二个适应性变异集中区域发生于NS3丝氨酸蛋白酶区域的羧基端及NS3螺旋酶的氨基端3,5，三维构造显示大多数变异位于溶媒可接近的分子外表，在螺旋酶区域内，变异似乎限于一个特定的外表，研究显示HVNS3螺旋酶的RNA解链活性是RNA复制所必须的6，而该区域的变异对复制功能的影响需进一步研究.第三个适应性变异集中区域见于NS4B的两个非常独特的位点3,7，基于NS4B的拓扑模型，在K1846T位氨基酸发生替代的情况下，这两个位点位于与透膜区2和3连接的胞质环

4、上，在1897位氨基酸发生替代的情况下，那么位于透膜区4的胞质羧基端，在T2传代HV基因组复制子中7，还发现1897位苯丙氨酸替代缬氨酸，这个基因组是HV感染T2细胞克隆的共有序列并经历了屡次传代，说明同样的细胞培养适应性变异发生于不同的HV别离株.最近，对长期细胞培养1218中，HV复制子的基因变异及复制动力学研究发现，复制子的基因变异呈现时间依赖性的累积，变异率约为每年每个位点3.010-3碱基替代，复制子的基因离散度diversity也随时间扩大，来自不同时间点的复制子RNA转染Huh7细胞提醒随时间累积的基因变异明显改善克隆形成效率8.1.2适应性变异对HV复制的影响最初，将一些细胞培

5、养适应性变异插入亲代复制子中，定量转染后测定G418抗性集落的数量，发现特定区域变异的插入致集落形成效率增加，NS5A区某些变异的插入，集落形成效率较亲代增加1104倍1.功能性挑选检测发现高效率的复制子常有多个位点发生适应性变异.目前，有4个HV别离株的复制子系统即：n19，HVN10，H771及JFH111序列.HVN与JFH1序列不需要适应性变异即能在Huh7细胞中有效复制，实验证明NS5A区4个氨基酸SSYN的插入与HVN序列的有效复制有关.H77序列复制子至少需要两个适应性变异1,5，S2204I，A1226D或P1496L，含有P1496L及S2204I的复制子较仅含有S2204L

6、复制子的复制效率高3104倍，而含有A1226D及S2204I的复制子较仅含有S2204L复制子的复制效率高800倍；仅含有P1496L复制子较含有P1496L及S2204I的复制子的复制效率低250倍，说明P1496L结合S2204I适应性变异是有效的H77复制子复制所必需的.n1复制子的适应性变异研究较深化，发现了一系列的适应性变异位点2,3，其中，NS5B区R2884G适应性变异效率最高.在n1复制子的研究中还证明了复制子的高程度复制无细胞毒性作用.此外，Lhann等3发现两个高度适应性变异位点的组合使复制子的复制才能明显下降.实验显示，与不含适应性变异的复制子比拟，NS4B区P1936

7、S变异复制才能增加12倍，NS5A区E2163G变异复制才能增加60倍，NS5B区R2884G变异的复制才能增加500倍，而NS4B加NS5B区结合变异，其复制才能仅增加20倍，NS5A加NS5B区结合变异那么未见克隆集落的形成.因此，这些变异可能具有性质相反的作用inpatibility.NS3区变异总是与NS4B，NS5A，NS5B区至少1个变异相关，NS4B，NS5A或NS5B区单个变异赋予细胞培养的适应性机制似乎不同于NS3区的变异.由上可见，适应性变异可发生于所有HV非构造蛋白区域，根据其对复制效率及协同性的影响，适应性变异至少可分为两组：NS3区变异：对复制效率影响小，但与高度适应

8、性变异结合，可协同增加复制效率；NS4B，NS5A，NS5B区变异：对复制效率有明显的增强作用，但互相之间结合可引起复制效率降低.此外，有人12构建了一个含有1bNS35A骨架和2bNS5B的嵌合性1b:2b复制子，仅在NS5B区含有一个新的适应性变异，即能在Huh7细胞中有效复制.1.3适应性变异增加RNA复制效率的机制目前尚不清楚.根据一些实验结果显示，NS3和NS5B区的替代常常位于分子的外表及远离各个酶活性中心，推测细胞适应性变异主要是直接或间接地影响了复制子与宿主细胞因素的互相作用13.1.4细胞培养适应性变异对体内感染性的影响在细胞培养适应性变异的研究中发现病毒基因的体内感染性与体

9、外复制才能明显不一致1,9,10,14.HVn1亲代基因不含适应性变异的别离株肝内接种黑猩猩1k后，动物即出现病毒血症，随后开展为持续性感染，平均病毒滴度达1108Eq/L，但其复制子的复制才能很弱，而在该基因的NS3区引入2个适应性变异E1202G,T1280I及NS5A区引入1个适应性变异S2197P的子代基因那么完全丧失了体内感染性，但体外复制才能明显增强，假如仅在NS5A区引入1个适应性变异，动物可被该子代基因感染，只是感染时间延后1k，而该基因复制子的复制才能较前者为弱.与上述观察相一致的是，HVN别离株体内感染性很弱，但其复制子即使缺乏细胞适应性变异在Huh7细胞中的复制效率也较强

10、，这是由于在NS5A中心区有4个氨基酸的插入而赋予了该分子的适应性表型及体内耐受.另一个国际上知名的HV序列H77别离株具有很强的体内感染性，但其复制子的构建那么经历了相当困难的过程，在H77序列的NS5A区引入了一个适应性变异及NS3区引入了一个协同变异且采用了高度容受性的Huh7.5细胞系后，H77复制子才构建成功.最近，Sarrazin等15对26名慢性HV1型感染患者的病毒基因NS3区和NS4BNS5B区含常见的31个复制子适应性变异位点的序列进展了研究，共发现5例患者分别在NS3区存在特异性变异P1112R，R1283G和S1496，该变异与基线HVRNA载量无关，但与干扰素治疗过程

11、中RNA浓度缓慢下降有关.2宿主细胞容受性宿主细胞容受性是指体外培养细胞支持HV复制的才能.采用瞬时复制检测系统，发现同一Huh7细胞系不同传代细胞之间RNA复制程度可相差100倍以上，这种差异与引入复制子的适应性变异无关且在亲代HVn1RNA也可见这种现象3.然而，宿主细胞容受性的程度难以控制且其变化也不可预测.在细胞容受性有关因素的研究中，发现IRES依赖性HVRNA翻译过程及RNA稳定性方面的因素与此无关.这样，一个解释可能是细胞容受性程度由RNA复制所需的某些宿主细胞因素的量及活性决定，支持该推测的证据是实验中发现复制效率随着转染Huh7细胞的复制子RNA量的增加而降低，说明Huh7细

12、胞中某些因素限制了RNA的复制.另一证据是有研究发现有效的HVRNA复制仅发生于Huh7细胞的一个亚群，推测非适应性的HV复制子转染后G418抗性集落形成的数量减少，不仅决定于引入的适应性变异的频率还决定于特定宿主细胞的容受性，G418挑选后获得的细胞克隆会含有细胞培养适应性复制子和/或是选择出的具较高程度容受性的细胞亚群，实验也证明了这个假设16，用干扰素或能有效阻断复制子RNA增殖的选择性抑制剂处理携带稳定复制HVRNA的Huh7细胞克隆，约2k后，大多数HVRNA分子被去除，产生了一群所谓的“ured细胞，用选择性复制子再转染这些细胞，与未转染过HVRNA的Huh7细胞nave比拟而言，

13、G418抗性集落的数量明显增多，说明在G418处理过程中，具有较高容受性的Huh7细胞被选择出来了.然而，由于容受性不是一种稳定的表型，且用于比拟的“nave细胞也会发生变化，故“ured细胞与“nave细胞间容受性的差异是难以制备的，如实验显示“ured细胞较“nave细胞第8代或第37代有更高的容受性，而较第128代或142代的容受性低，同时显示“ured细胞容受性也不具有稳定的特性.Zhu等17根据HV具有准种的特性，想象到病毒群可能含有可以在不同细胞类型及不同种系中复制的变异株，且细胞培养适应性变异可能扩大HV的宿主细胞范围，讨论了HV在肝外组织及非灵长类细胞中复制的可能性，发现亚基因

14、组HV复制子可以在小鼠肝癌细胞系及人类上皮细胞HeLa中复制，从这种复制子细胞中别离的复制子含有一些新的变异，主要集中于NS4B与NS5A区，且发现几个在Huh7复制子中从未出现的适应性变异，说明可能存在细胞类型特异性的适应性变异现象.该实验同时证明HVRNA复制并不绝对依赖于肝细胞或灵长类特异性的因素，换言之，影响HV复制的宿主因素并非是肝细胞及灵长类特异性的.综上所述，有关细胞培养适应性变异和宿主细胞容受性的深化研究，对最优化的构建不同基因型传统的复制子或复制子瞬时系统及拓展容受性好的细胞系奠定根底，从而有助于进一步建立能产生感染性病毒颗粒的系统，以便于病毒复制周期的研究，更重要的是宿主细

15、胞系的拓展可排除特定细胞系特异性因素的影响，使采用该模型系统所进展的研究更具可靠性.【参考文献】1BlightKJ,KlykhalvAA,Rie.EffiientinitiatinfHVRNArepliatininellultureJ.Siene,2000,290(5498):1972-1974.2LhannV,KrnerF,DbierzeskaA,etal.utatinsinhepatitisvirusRNAsnferringellultureadaptatinJ.JVirl,2001,75(3):1437-1449.3LhannV,HffannS,HerianU,etal.Viraland

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