浅析对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因多态性分型研究

1、浅析对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因多态性分型研究【摘要】目的探究一种正确、快速、可靠的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(RSA)的分子生物学分型要领，相识病院内RSA的多态性，为临床公正、有用地利用抗生素和操纵耐药基因在种群间的流传提供帮助。要领用eA基因相干高变区PR扩增(HVR-PR)和随机扩增多态性DNA(RAPD)两种要领，对RSA菌株举行多态性阐发。HVR-PR检测eA基因相干高变区正相重复序列元件(DRUs)的长度，按照DRUs数量标差异对RSA分型;RAPD按照电泳图谱中条带的数量及位置，经NTSYS统计软件举行聚类阐发，得到遗传树状图，按RSA菌株之间的相干性举行分型。结果应用HVR

2、-PR要领可将31株RSA标天职为7型，别离含有7、8、9、10、11、12和16个DRUs，此中10DRUs型最多11/31(35.48%)，16DRUs型最少1/31(3.23%);应用RAPD分型，31株RSA共分10型，此中以型为主10/31(32.26%)，其他型漫衍比力靠近。在11株HVR-PR分型的10DRUs型中RAPD型4株4/11(36.36%)，RAPD型和RAPD型各2株2/11(18.18%);10株RAPD型中9DRUs型、10DRUs型各4株4/10(40.00%)。结论RAPD要领和HVR-PR要领对RSA的分型率都比力高，并且这两种要领都比力简朴、不变、可靠、

3、快速，有用性强，具有辽阔的应用远景。【关键词】耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;eA基因;随机扩增多态性DNA;eA基因相干高变区PR扩增KEYRDS:ethiillin-resistantStaphylusaureus;eAgene;randaplifiedplyrphiDNA;PRfrthee-assiatedhypervariableregin葡萄球菌的分型要领许多，传统的分型要领包罗血清学分型、抗生素分型等，但均无法满意正确区分的要求。分子生物学技能的出现为这一范畴带来了革命。如今，分子分型要领已成为研究细菌耐药性产生及流传的紧张本领，常见的有：脉冲场凝胶电泳(pulsed-fielgelel

4、etrphresis,PFGE)，随机扩增DNA多态性(randaplifiedplyrphiDNA,RAPD)，eA基因高变区长度多态性(PRfrthee-assiatedhypervariableregin,HVR-PR)，荧光扩增片断长度多态性(fluresentaplifiedfragentlengthplyrphris,FAFLP)等。这些要领各有特点，应用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ethiillin-resistantStaphylusaureu,RSA)的分型在国表里均有报道，但这些要领尚未成熟，各地分型尺度也不一样，且多接纳单一的分型要领。RAPD和HVR-PR团结应用于RS

5、A多态性分型尚未见报道。本实行接纳RAPD和HVR-PR两种要领对RSA菌株举行分型，相识其多态性漫衍状态、区分菌株之间的相干性，为公正、有用地利用抗生素和操纵耐药基因在种群间的流传提供理论基矗1质料与要领1.1质料1.2要领2结果2.1RSA的HVR-PR分型结果应用HVR-PR要领对31株RSA标本举行分型，一共可以分为7型，别离含有7、8、9、10、11、12和16个DRUs。全部的RSA都可以扩增出长度450820bp的基因片断，用HVR-PR分型要领都可以加以区分，分型率到达了100%。DRUs的数量=(扩增的基因片断长度-171)/40，此中171是存在于扩增序列之中而没有重复的序

6、列片断长度，40是每一个正向重复单位序列的长度。全部RSA菌株中，10DRUs型最多(11/31，35.48%)，其次是9DRUs型(8/31，25.81%)，11DRUs型(4/31，12.90%)，7DRUs型(3/31，9.68%)，12DRUs型(2/31，6.45%)，8DRUs型(2/31，6.45%)，最少的是16DRUs型(1/31，3.23%)。2.2RSA的RAPD分型结果应用RAPD与HVR-PR对31株RSA举行团结分型，这两种要领的分型率都比力高，都到达了100%。在11株HVR-PR分型的10DRUs型中RAPD型4株(36.36%)，RAPD型和RAPD型各2株(

7、18.18%);10株RAPD型中9DRUs型、10DRUs型各4株(40.00%)(表2)。表2RAPD与HVR-PR对RSA的团结分型图331株RSA的遗传间隔树状图Fig.3Thegenetidistanetreef31RSAs横坐标为相干系数，纵坐标为菌株编号。3讨论按照HVR多态性，将31株RSA分为7型，以10DRUs型多见，共11株(35.5%)，16DRUs型少见，只有1株(3.23%)。SENNA等1报道，按照HVR多态性将从巴西PrtAlegre地域分散的254株RSA分为8型。本实行未创造3DRUs型及5DRUs型，而多了16DRUs型，这大概与菌株数较少有关，也大概当地

8、域无此型菌株存在，有待进一步研究。接纳HVR-PR法对RSA举行分型，与RSA的表型分型法、药敏试验相团结，对付追踪RSA熏染源、操纵盛行、引导临床抗菌药物的公正应用具有紧张意义。别的，RSA中dru差异重复次数有何详细生物学意义，即片断巨细差异对PBP2a构型及其介导耐药性凹凸的干系有何影响，国表里尚无报道，有待进一步探究。SHITZ等3用PFGE、RAPD、16-23SrDNA、卵白APR、HVR-PR、凝固酶基因PR对183株RSA分型，创造PFGE结果与HVR-PR结果相近，对RSA都有比力高的区分本领。IHELHAUS等4同时应用凝固酶基因多态性、spa基因多态性，eA基因高变区长度

9、多态性及PFGE对46株RSA举行分子分型研究，证明了这3种特异成效团体的多态性分型要领与PFGE分型同等，得当于短时间如几天到几周内的盛行病学阐发，12h可出结果，而PFGE那么需5d或更长时间。固然HVR-PR没有PFGE对RSA分型结果好，但是比凝固酶基因PR更能有用地对RSA分型，并且分型率比力高，对其盛行病学研究有紧张的意义5。eA基因是耐甲氧西林葡萄球菌所特有，而HVR基因高变区与该基因精细相连，存在于其卑劣，也具有特异性。HVR-PR法操纵简朴、快速，不必要特别的电泳装备和限定酶消化，大多数的临床微生物实行室皆可举行。本实行在药敏试验的底子上接纳双引物RAPD法对31株RSA举行

10、了基因分型，按照RAPD电泳图谱中条带的数量及位置，经NTSYS统计软件举行聚类阐发，得到遗传树状图。31株RSA共分为10个基因型。韩立中等6用RAPD法将检测菌株分为4个型别(AD型)，分型区别较大的缘故原由大概是RAPD引物选择的差异，别的由于利用随机的引物，一旦基因组DNA分子产生片断插入、缺失或碱基突变，将造成引物特定团结位点的变革，使PR扩增产物的条带产生分子量和数量标改变。ILLE等7在美国纽约市立病院及纽约疾病操纵中央共网络103株金黄色葡萄球菌，用RAPD分型要领共检测出71株RSA，检出率高达69%，此中52株被以为与病院和社区熏染有关，其他19株同源性相差较远，被以为是盛

11、行病学无关株。VANBELKU等8曾用3种RAPD引物(RAPD1、RAPD7和ERI2)对金黄色葡萄球菌分型，并同PFGE作比力，证明RAPD是金葡菌基因阐发以及监测病院熏染盛行较抱负的分型本领。RAPD的特异性好、阐发周期短、浅易、不变、可靠、不必要特别试剂和生物质料，有用于全部生物的分型，尤其是对一些尚未创立尺度分型要领和缺乏血清型等要领的菌属(种)的断定和分型特别有用。美国病院盛行病学协会已保举该要领为病院熏染中常见病原菌的分型要领9。因此，RAPD技能在熏抱病学、微生物盛行病学和病院内熏染学范畴有很好的应用远景。在RSA的盛行病学研究中，每每会把几种要领团结利用，如许对RSA的盛行病

12、学阐发每每会越发正确。李家泰等10接纳HVR-PR基因型和肠毒素基因型相团结，创造两种基因型团结起来有助于进步RSA分型的可靠性。本实行将RAPD要领与HVR-PR要领相团结，以药物敏感实行为底子，对临床分散的RSA做盛行病学阐发。RAPD要领和HVR-PR要领对RSA的分型率都比力高，都到达了100%，并且这两种要领都比力简朴、不变、可靠、快速，可以在短时间内对RSA举行分型。研究中还创造这两种要领之间没有很好的相干性，即雷同的RAPD型可以表示出差异的HVR-PR型;反之，雷同的HVR-PR型也可以出现出差异的RAPD型。【参考文献】1SENNAJP,PINTA,ARVALHLPS,eta

13、l.parisnfpulsed-fieldgeleletrphresisandPRanalysisfplyrphissntheehypervariablereginfrtypingethiillin-resistantStaphylusaureusJ.Jlinirbil,2002,(6):2254-2256.2TABIA,PEREG,TALSANIAH,etal.Analysisfanutbreakfnn-phage-typeableethiillin-resistantstaphylusaureusbyusingarandlyaplifiedplyrphiDNAassayJ.Jlinirbi

14、l,1997,35(12):3092-3097.3SHITZFJ,STEiERT,TIHYiHV,etal.Typingfethiillin-resistantStaphylusaureusislatesfrDsseldrfbysixgentypiethds.Jedirbil,1998,47(4):341-351.4IHELHAUSTA,HUNFELDKP,BDDINGHAUSB,etal.RapidleulartypingfethiillinresistantStaphylusaureusbyPR-RFLPJ.InfetntrlHspEpideil,2001,22(5):294-298.5N

15、ISHIJ,YSHINAGA.Anepideilgisurveyfethiillin-resistantStaphylusaureusbybinedusefe-HVRgentypingandtxingentypinginauniversityhspitalinJapanJ.InfetntrlHspEpideil,2002,23(9):506-510.6韩立中，王大方，杨莉.上海地域3所病院RSA的随机扩增多态DNA分型J.中国熏染与化疗杂志,2022,7(12):88-91.7ILLE,VANL.ValiatinfbinarytypingfrStaphylusaureusstrainsJ.ASietyirbil,1999,37(3):664-674.8VANBELKUA,KLUYTANSJ,VANLEEUEN,etal.ultienterevaluatinfarbitrarilypriedPRfrtypingfStaphylusaureusstrainsJ.Jlinirbil,1995,33(6)