FasL反义寡核苷酸逆转肝癌细胞免疫逃逸 的实验研究

1、FasL反义寡核苷酸逆转肝癌细胞免疫逃逸 的实验研究【摘要】目的：研究FasL反义寡核苷酸对肝癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸的逆转作用。方法：用流式细胞术检测肝癌细胞系HepG2.2.15细胞外表Fas、FasL的表达及Jurkat细胞外表Fas的表达；用HepG2.2.15细胞与Jurkat细胞共培养方法，研究FasL诱导T细胞凋亡的功能；用脂质体介导法转导FasL反义寡核苷酸入肝癌细胞，并通过检测细胞外表FasL表达、RTPR及细胞共培养方法研究FasL反义寡核苷酸转导对肝癌细胞免疫抑制的逆转作用。结果：HepG2.2.15细胞低表达Fas，却表达有功能的FasL，与高表达Fas的Ju

2、rkat细胞共培养可诱导后者凋亡；肝癌细胞转入FasL反义寡核苷酸后，FasLRNA降低；细胞外表FasL表达下降；与Jurkat细胞共培养，Jurkat细胞的凋亡率下降。结论：肝癌细胞表达的FasL可抑制T细胞的免疫功能，是肝癌细胞免疫逃逸的重要机制之一；FasL反义寡核苷酸转导可以逆转肝癌细胞的免疫抑制作用。【关键词】肝肿瘤Fas/FasL免疫逃逸寡核苷酸类，反义TheFasLantisenselignuletideuldreversetheiuneesapeinhepatarinaellline【ABSTRAT】bjetive:TinvestigatethereverseatinfFas

3、LantisenselignuletidentheiuneesapethrughFas/FasLpathayinhepatarinaells.ethds:Fas、FasLexpressinfhepatarinaelllineHepG2.2.15andFasexpressinfJurkatellereexainedbyflytetry.FasLfuntinfinduingTlyphytestapptsisasassessedbyultrueassaysinvitrusinghepatarinaellsHepG2.2.15andJurkatells.Thehepatarinaellseretran

4、sfetedithFasLantisenselignuletideediatedbylipfetin.ThereverseatinasinvestigatedbytheaysfdetetingtheFasLexpressin,RTPRandultureassays.Results:HepG2.2.15ellsexpressFasataveryllevel,butexpressfuntinalFasLhihuldindueJurkatellsithhighFasexpressintapptsisinultrueassays,Afterthehepatarinaellseretransfetedi

5、thFasLantisenselignuletide,theFasLRNA,theratefFasLexpressinandtheappttiratefJurkatellsinultureassaysalldereased.nlusin:FasLexpressedbythehepatarinaellsuldinhibittheiunefuntinfTlyphytes.Itasneftheiprtantehanissfiuneesapeinhepatarinaells.FasLantisenselignuletideuldreversetheatinfiuneinhibitin.【KEYRDS】

6、LiverneplassFas/FasLIuneesapelignuletide,antisense近年研究发现，某些肿瘤细胞表达FasL，可以与激活的T细胞外表的Fas结合，诱导T细胞凋亡，从而还击宿主免疫系统，逃防止疫监视。本实验对人肝癌细胞株HepG2.2.15细胞FasL的表达及功能进展检测，讨论肝癌细胞通过Fas/FasL途径的免疫逃逸机制，并设计合成特异的FasL反义寡核苷酸ASDN，封闭肝癌细胞FasL的表达，以期阻止免疫细胞凋亡，逆转肿瘤细胞的免疫逃逸。1材料和方法1.1仪器和试剂兔抗人Fas、FasL多克隆抗体，为Santaruz公司产品。FIT标记的羊抗兔IgG抗体，购自华

7、美生物公司。鼠抗人FasL中和性单克隆抗体NK2、AnnexinVFIT凋亡检测试剂盒及流式细胞仪FASan,均为美国BD公司产品。脂质体ligfetaineTReagent,为美国Invitrgen公司产品。TRIzlReagent、ReverseTransriptase、TaqDNAplyerase等RTPR用试剂，均购自上海生工生物工程技术公司，引物及FasL反义、正义寡核苷酸SDN，由上海生工生物工程技术公司合成。1.2细胞培养人肝癌细胞株HepG2.2.15及Jurkat细胞由中国医学科学院提供。HepG2.2.15细胞培养于含10%胎牛血清的DE培养液中；Jurkat细胞培养于含1

8、0%小牛血清的RPI1640培养液中。37、5%2、饱和湿度下培养。1.3流式细胞术F检测肝癌细胞外表Fas、FasL表达及Jurkat细胞外表Fas表达搜集正常生长的HepG2.2.15细胞及Jurkat细胞，PBS洗两次，分别参加130稀释的兔抗人Fas、FasL抗体，用PBS代替一抗作阴性对照，4反响30in；PBS洗一次，参加190稀释的FIT标记的羊抗兔IgG抗体，4避光反响30in，PBS洗一次，参加PBS500l，上机检测。1.4肝癌细胞FasL功能检测HepG2.2.15细胞2106/孔接种至6孔培养板，培养至细胞密度达80%以上时，去除培养液并冲洗板孔。实验组A组：HepG2

9、.2.15细胞参加Jurkat细胞4105/孔；NK2处理组B组：HepG2.2.15细胞参加10g/l的FasL中和抗体NK2400l，孵育1h后参加与A组等量Jurkat细胞；对照1组组：Jurkat细胞单独培养；对照2组D组：Jurkat细胞参加与B组等量NK2。继续培养24h，搜集悬液的Jurkat细胞，加PI及AnnexinVFIT染色，F检测细胞凋亡。可出现四个细胞群；死亡细胞Annexin-/PI+、正常活细胞Annexin-/PI-、早期凋亡细胞Annexin+/PI-、中晚期凋亡细胞Annexin+/PI+。1.5FasL反义寡核苷酸转染肝癌细胞设计FasLASDN序列与Fa

10、sLRNA的翻译起始密码子互补为：5GTAATTGAAGGGTGTGAT3；FasLSDN序列：5ATGAGAGTTAATTA3，均经硫代化修饰。HepG2.2.15细胞1.5106/孔接种至6孔培养板，培养至细胞密度达30%50%时，去除培养液并用无血清培养基洗一次，每孔参加无血清DE800l。分别将6，10，14l浓度为20l/L的FasLASDN/SDN及按41体积比的ligfetaineT各自用无血清DE稀释后，一一对应混匀，各形成FasLASDN/SDNligfetaine复合体200l，室温放置1520in后，分别参加细胞中，并设未处理对照组。转染液中FasLASDN/SDN的浓度

11、分别为120，200，280nl/L，培养4h后，撤出转染液，参加含10%胎牛血清的DE培养液，继续培养48h后搜集细胞。1.5.1F检测ASDN/SDN转染细胞后FasL表达搜集不同剂量各处理组及对照组细胞，F检测FasL的表达，方法同前。1.5.2半定量RTPR法检测ASDN/SDN转染细胞后FasLRNA程度的变化搜集FasLASDN/SDN的转染浓度为200nl/L的处理组及对照组细胞，按TRIzlRengent操作说明提取总RNA，逆转录合成DNA，然后PR扩增，FasL引物为5GGATTGGGTGGGGATGTTTA3，和5TTGTGGTAGGGGAGGTTGTTG3，扩增片段34

12、4bp;atin引物为5GTGGGGGAGGA3和5TTTAATGTAGAGATTT3，扩增片段506bp。循环参数：变性9615se，退火5530se，延伸723in，扩增40个循环。扩增产物点样到1.5%琼脂糖凝胶中，加DNAarkerDL2000作参照，35V/，电泳1h，GelDs1000凝胶图像分析仪扫描各条带，用leularAnalysis软件，以atin基因作内参照，分析各组FasLRNA的相对表达量。1.5.3F测Jurkat细胞与4组HepG2.2.15细胞共培养后细胞凋亡变化取FasLASDN/SDN转染浓度为200nl/L的处理组及对照组细胞，去除培养液并冲洗板孔。参加J

13、urkat细胞5105/孔，继续培养24h后，搜集悬浮的Jurkat细胞，加PI及AnnexinVFIT染色，F检测细胞凋亡。1.6统计学方法多组均数两两比拟采用q检验，两均数比拟采用t检验。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1肝癌细胞外表Fas、FasL表达及Jurkat细胞外表Fas表达肝癌细胞系HepG2.2.15细胞外表Fas的表达率为1.240.31%,FasL的表达率为18.031.03%,Jurkat细胞外表Fas的表达率为87.231.90%见图1。2.2肝癌细胞FasL功能检测实验组Jurkat细胞与HepG2.2.15细胞共培养后凋亡率为21.412.11%,NK2处理组、对

14、照1组、2组Jurkat细胞凋亡率分别为8.911.00%、4.191.97%、5.671.45%，实验组与NK2处理组、对照1组、2组均有统计学意义q=17.483,24.084,22.014,均P0.01。对照1组、2组差异无统计学意义q=2.070,P0.05(见图2)。2.3肝癌细胞转染FasLASDN后的变化2.3.1HepG2.2.15细胞FasL表达率HepG2.2.15细胞经FasLASDN作用后FasL的表达率下降，FasLASDN浓度为120，200，280nl/L的处理组FasL的表达分别为13.071.23%、7.940.94%、(5.541.17)%，分别与对照组18

15、.061.47%比拟差异均有统计学意义t=4.509,10.046,11.542,P0.05,P0.001，并呈剂量相关性。相应浓度FasLSDN处理组FasL表达分别为17.571.42%、16.441.57%、17.251.50%，与对照组差异无统计学意义t=0.415,1.305,0.668,均P0.05(见图3)。2.3.1HepG2.2.15细胞FasLRNA程度HepG2.2.15细胞经FasLASDN作用后FasLRNA程度下降，电泳图像示条带变浅，以atin基因作内参照，ASDN组FasLRNA的相对表达量为0.3433，而对照组及SDN组分别为0.8023、0.8512见图4

16、。2.3.3与HepG2.2.15细胞共培养后Jurkat细胞凋亡率HepG2.2.15细胞经FasLASDN作用后，与Jurkat细胞共培养，Jurkat细胞凋亡率下降，为11.041.12，与对照组21.811.84比拟差异有统计学意义t8.660，P0.001。SDN组Jurkat细胞凋亡率为21.551.90，与对照组差异无统计学意义t0.170，P0.05见图5。3讨论Fas和Fasl互相作用是诱导细胞凋亡的重要途径。研究发现，某些肿瘤细胞不仅可以通过FasFasL系统抵抗Fas介导的凋亡，并且能还击免疫细胞使T细胞凋亡。文献报道人黑色素瘤、结肠癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤细胞外表均有

17、FasL的表达1，2，3，FasL与激活的T细胞外表的Fas结合，诱导T细胞发生凋亡，从而还击宿主免疫系统，逃避机体免疫监视4，导致肿瘤发生和开展。为讨论肝癌细胞通过Fas/FasL途径的免疫逃逸机制，本实验用F检测人肝癌细胞系FasL的表达阳性率为18.03。肿瘤特异抗原能诱导TIL高表达Fas，使T细胞对FasL诱导的凋亡敏感5。Jurkat细胞来源于人T淋巴细胞白血病细胞，与活化的T细胞功能相似，可作为活化的T细胞广泛应用于实验。Jurkat细胞高表达Fas，本实验Fas表达阳性率为87.23%。HepG2.2.15细胞与Jurkat细胞共同培养结果显示，HepG2.2.15细胞可诱导J

18、urkat细胞发生凋亡，凋亡率为21.41%；用FasL中和抗体NK2封闭HepG2.2.15细胞外表FasL后，再与Jurkat细胞共培养，Jurkat细胞凋亡率下降为8.91%；实验组与NK2处理组、对照组比拟均有显著差异；而Jurkat细胞参加NK2并不影响其凋亡情况。说明肝癌细胞外表的FasL有诱导淋巴细胞凋亡的作用，从而能抑制机体免疫细胞的功能。肝癌细胞外表Fas表达常常下调或缺失，本实验发现HepG2.2.15细胞Fas表达阳性率仅为1.24%。Fas低表达使肝癌细胞可以免于FasL的攻击，抵抗Fas介导的凋亡。肝癌细胞以及激活的T细胞表达的FasL不能作用于癌细胞，那么转而作用于

19、高表达Fas的T细胞，诱导其凋亡。由此可见，肿瘤细胞在与免疫细胞互相作用过程中，能利用FasFasL途径反向作用于免疫效应细胞，在自身受到免疫攻击之前诱导免疫细胞凋亡，从而主动逃避机体免疫监视。有研究发现6，高转移肝癌细胞株FasL表达明显高于低转移株，可见表达FasL的肿瘤细胞由于能抑制淋巴细胞功能，逃避机体免疫细胞的杀伤，使细胞伴有高转移潜能。因此，异常表达FasL，抑制机体免疫功能是肝癌发生和开展的重要机制之一。肿瘤细胞表达FasL还击T细胞这一重要的免疫逃逸机制的说明，为针对FasFasL为靶点制定肿瘤的免疫治疗策略提供了新的思路和理论根据。阻断FasL介导的肿瘤细胞对免疫细胞的杀伤作

20、用，那么有望逆转肿瘤细胞的免疫逃逸7。其中，封闭肿瘤细胞的FasL表达是重要途径之一。反义基因技术是近年来开展起来的一种新技术，通过合成针对某种基因的反义寡核苷酸，经脂质体包裹等方法导入细胞后，能以多种作用方式影响目的基因的转录，阻止RNA的翻译，起“基因封条的作用。反义基因特异性强，细胞毒性小，具有良好的临床应用前景，目前已广泛受到关注，但国内尚未见将FasL反义寡核苷酸转导入肿瘤细胞的报道。本实验设计合成特异的FasL反义寡核苷酸，转导入表达FasL的肝癌细胞，有效地使细胞内FasLRNA降低，细胞外表FasL表达下降，Jurkat细胞与之共培养后的凋亡率下降。从基因蛋白细胞效应三方面观察到FasL反义基因能有效地封闭肝癌细胞外表FasL表达，使肝癌细胞诱导T细胞凋亡的才能减弱，阻断肿瘤细胞对免疫细胞的杀伤，逆转其免疫抑制作用，为肝癌的反义基因治疗提供了理论根据。参考文献1nnellJ,SullivanG,llinsJK,etal.TheFasunterattak:FasediatedTellkillingbylnanerellsexpressingFasligandJ.JExpe