因工程制药工艺

1、关于因工程制药工艺第一张，PPT共六十一页，创作于2022年6月第六章 基因工程制药工艺6.1 基因工程制药微生物表达系统6.2 基因工程大肠杆菌的构建6.3 基因工程菌的发酵培养与控制第二张，PPT共六十一页，创作于2022年6月基因工程技术基因重组示意图DNA片段经酶切、连接，形成重组DNA分子导入宿主细胞系统中扩增目标基因表达，生成新产物，出现新性状第三张，PPT共六十一页，创作于2022年6月6.2 基因工程大肠杆菌的构建技术6.2.1 构建流程6.2.2 目标基因的克隆6.2.3 表达载体构建6.2.4 工程菌构建第四张，PPT共六十一页，创作于2022年6月6.2.1 工程菌构建流

2、程目标基因克隆PCR、文库，化学合成表达载体构建酶切、连接遗传转化与筛选外源基因导入与培养工程菌新性状、功能、物质工作内容方法第五张，PPT共六十一页，创作于2022年6月6.2.2 目标基因的克隆策略目标基因：编码蛋白质或多肽的DNA序列正确克隆的重要性： 只要有一个碱基发生（错义、无义、移码）突变，就导致编码氨基酸的变化，影响产物蛋白质的功能和生物学活性。 只要一个碱基发生同义突变，就可能导致生产过程和效率变化。第六张，PPT共六十一页，创作于2022年6月基因克隆方法的选择方法优点缺点PCR扩增简便快速，高效，数kb，单基因克隆DNA聚合酶活性和保真性限制文库筛选长片段，无碱基错误，未知

3、序列基因克隆繁琐，过程复杂，耗时，昂贵化学合成简便，准确，已知序列，引物合成受合成仪器性能限制，长度很短第七张，PPT共六十一页，创作于2022年6月PCR技术PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）：由DNA聚合酶催化下，对特定DNA序列进行的复制反应。本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基因。发明者：Mullis，生物技术革命性象征，1993年获得诺贝尔化学奖。第八张，PPT共六十一页，创作于2022年6月在引物指导下，以DNA为模板，由DNA聚合酶催化的扩增特定DNA序列聚合延伸形成互补序列的反应。3AGCGAGGCATCG55TCGCTCCGTAG

4、C3第九张，PPT共六十一页，创作于2022年6月PCR单反应原理与过程(1)变性（94）(2)退火（55）(4)完成一个循环(3)延伸（72）第十张，PPT共六十一页，创作于2022年6月PCR扩增的反应体系组成成分浓度用量作用缓冲液10 x5 ul提供反应环境dNTPs20 mmol/L1 ul反应的底物正向引物20 umol/L2.5 ul扩增的起始点反向引物20 umol/L2.5 ul扩增的终止点DNA聚合酶1-5 U/ul1-2 U催化，热稳定性MgCl21.5-5.0 mmol/L1 ulMg2+是辅酶模板DNA5-10 ul含目标基因序列H2O27-33 ul稀释总体积50 u

5、l第十一张，PPT共六十一页，创作于2022年6月PCR扩增产物电泳PCR仪水平电泳槽凝胶电泳第十二张，PPT共六十一页，创作于2022年6月6.2.2 RT-PCR克隆目的基因流程提取RNA转 cDNA设计合成引物基因片段的3/5末端扩增RT-PCR扩增全长基因基因片段扩增第十三张，PPT共六十一页，创作于2022年6月6.2.2 RT-PCR克隆目的基因流程第十四张，PPT共六十一页，创作于2022年6月1 提取RNA从表达基因的组织中提取总RNA，或mRNA可以用RNA提取kit, Unizol, Trizol大量提取时可以用传统的一步法提取-Unizol 或 Trizol 是总RNA提

6、取试剂，在配制过程中加入了异硫氢酸胍，能够在组织匀浆过程中迅速灭活RNA酶，保持RNA的完整性。第十五张，PPT共六十一页，创作于2022年6月总RNA提取操作步骤 ：1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5 min，使其充分裂解。注：此时可放入-70长期保持。 2、12,000 rpm 离心5 min，弃沉淀。 3、按200 l氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15 min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。 4、4 12,000 g离心15 min。 5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4冰箱，

7、若只提RNA，则弃下层酚相。 第十六张，PPT共六十一页，创作于2022年6月6、按0.5 ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置510 min。 7、4 12,000 g离心10 min，弃上清，RNA沉于管底。 8、按1 ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。 9、 4 8,000g离心5 min，尽量弃上清。 10、室温晾干或真空干燥510 min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。 11、可用50 l H2O，TE buffer溶解RNA样品，5560,510min。注：H2O、TE须用DEPC处理并高压。 第十七张，

8、PPT共六十一页，创作于2022年6月RNA提取注意事项严格防止RNA酶污染1. 佩戴一次性手套 2. 玻璃器皿可以在250烘箱中烘烤3小时 3. 枪头、Eppendorf管用0.1%DEPC（搅拌搅匀）水中浸泡。通风橱中室温过夜，扣去液体，高压灭菌30分钟。 DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。4. DEPC处理的水：0.1%DEPC处理，高压灭菌30分钟脱毒5. 防止环境中RNA酶污染第十八张，PPT共六十一页，创作于2022年6月2. 转cDNA（防RNA酶）逆转录: 将mRNA转录成为cDNA逆转录酶：依赖于RNA 的

9、DNA聚合酶(反转录酶) 禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶 鼠白血病病毒(MLV)反转录酶, 降解RNA DNA杂交体中的RNA 的能力较弱, 对热的稳定性较AMV反转录酶差cDNA合成: 1. 总RNA 2. 底物，dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP 3. 引物,起始DNA的合成, oligo(dT) 4. 逆转录酶 5. DEPC处理水 温浴 ，按试剂盒说明书。 第十九张，PPT共六十一页，创作于2022年6月3. 引物设计特异性引物设计Specific primer简并引物设计Degenerated primer嵌套引物Nested Primer第二十张，PPT共

10、六十一页，创作于2022年6月1）长度1530 bp2）AT:GC 约50%， 两引物Tm值接近，5588之间。退火温度 Tm (4GC2AT)53）引物3末端以G/C结尾较好4）不形成引物二聚体5）特异性, 作BLAST搜索6）简并引物：保守序列；简并度低；具单一密码子 的氨基酸放在3 端7）逆向引物要用互补序列引物设计原则第二十一张，PPT共六十一页，创作于2022年6月 1）特异性引物设计基因序列已知时, 可以设计特异性引物特异性引物：有准确的碱基序列第二十二张，PPT共六十一页，创作于2022年6月第二十三张，PPT共六十一页，创作于2022年6月第二十四张，PPT共六十一页，创作于2

11、022年6月 F：XXXF，5- XXXXXX atggccgcttcgcgtgcaacg-3 atggccgctt cgcgtgcaac gtttgttgcg ctcgtgtgcg ctctcgcgct cgccgccgcc gatgtgcaga atccgctcag tgacgatttc atcaatctca tcaacacaaa gcaaaactct aacgaagtca gggaccaggg atcttgtggt agctgctggg gttcggtgc tgtggaggcc atgaccgacc ggtactgtac atactccaat ggaactcaac acttccattt

12、ctccgctga tcagcggagaaatggaagtgt-3R：XXXR，5- XXXXXX第二十五张，PPT共六十一页，创作于2022年6月2） 根据蛋白质同源序列设计简并引物DNAMAN当基因序列未知时,利用软件进行同源比对,设计间并引物第二十六张，PPT共六十一页，创作于2022年6月第二十七张，PPT共六十一页，创作于2022年6月用DNAMAN进行同源比对,设计引物将蛋白质序列保存为seq文件格式比对、系统树拷贝、保存第二十八张，PPT共六十一页，创作于2022年6月4. RT-PCR 扩增目的基因cDNA模板RNA/mRNAPCR扩增目的基因cDNAPrimer FPrime

13、r R第二十九张，PPT共六十一页，创作于2022年6月PCR循环94 C 294 C 3055 C 4572 C 172 C 10 25 l volume10 X buffer(含MgCl2)，2.5 l 2.5 mM dNTP， 2 lTemplate cDNA， 1 lForward Primer， 1 l Reverse Primer ， 1 lDistilled Water，17.375 l Taq 酶， 0.125 l 35第三十张，PPT共六十一页，创作于2022年6月6.2.3 酶切、连接、转化、筛选1.酶切反应概念：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。

14、5突出端3突出端平末端第三十一张，PPT共六十一页，创作于2022年6月分析基因的限制性内切酶谱，确定插入质粒的限制性内切酶位点 atgaactgtgtttg ccgcctggtc ctggtcgtgc tgagcctgtg gccagataca gctgtcgccc ctgggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgggccgag ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca cagctgaggg acaaattccc agctgacggg gaccacaacc

15、tggattccct gcccaccctg gccatgagtg cgggggcact gggagctcta cagctcccag gtgtgctgac aaggctgcga gcggacctac tgtcctacct gcggcacgtg cagtggctgc gccgggcagg tggctcttcc ctgaagaccc tggagcccga gctgggcacc ctgcaggccc gactggaccg gctgctgcgc cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga cccgccggcg cccccgctgg cgc

16、ccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca cgccatcctg ggggggctgc acctgacact tgactgggcc gtgaggggac tgctgctgct gaagactcgg第三十二张，PPT共六十一页，创作于2022年6月/第三十三张，PPT共六十一页，创作于2022年6月第三十四张，PPT共六十一页，创作于2022年6月酶切反应操作酶切体系组成：DNA，缓冲液，限制性内切酶反应条件：适宜温度（37），1小时以上终止反应：加热，加入EDTA，螯合镁离子电泳检查：酶切完全性超螺旋第三十五张，PPT共六十一页，创作于2022年6月3.连

17、接反应概念：在连接酶的催化下，将DNA双链上相邻的3羟基和5磷酸基团共价结合形成3-5磷酸二酯键，使两条断开的DNA链重新连接起来。 第三十六张，PPT共六十一页，创作于2022年6月连接反应操作连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连接酶连接反应：1626，数小时，或过夜终止反应：在70加热10分钟第三十七张，PPT共六十一页，创作于2022年6月4. 转化概念：把外源基因导入宿主细胞的过程。第三十八张，PPT共六十一页，创作于2022年6月大肠杆菌转化CaCl2法感受态细胞融化：置冰上，缓慢加入连接反应产物：混匀，置冰上30min热击：42，90s置冰上，12min扩增培养：加入LB培养基

18、，37，45min涂平板：含有抗生素的LB固体培养基上筛选培养：倒置平板，37，出现菌落。第三十九张，PPT共六十一页，创作于2022年6月5. 筛选与鉴定转化后的细胞类型非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞转化子：导入外源DNA的转化细胞非重组子：仅含有空载体分子的转化子重组子：含有重组DNA分子的转化子非目标重组子：连接不正确的重组子目标重组子：含有连接正确的重组子（目的）第四十张，PPT共六十一页，创作于2022年6月（1）筛选策略与方法基于载体抗生素筛选法抗生素抗性基因氨苄青霉素被Bla基因编码产物-内酰胺酶分泌到培养基水解。卫星菌落：大菌落具有抑制抗性，周围产生了相对抗性区，

19、允许一些没有抗性的原菌生长。第四十一张，PPT共六十一页，创作于2022年6月蓝白斑筛选-互补原理质粒lacZ标记基因，编码产物为 -半乳糖苷酶N端146aa，无活性，受体。大肠杆菌染色体DNA：编码C端部分序列，无酶活性，供体。受体与供体结合，恢复-半乳糖苷酶的活性，从而将无色X-gal底物水解成蓝色产物。有外源基因， 白色菌落；无外源基因， 蓝色菌落.第四十二张，PPT共六十一页，创作于2022年6月（2）鉴定方法菌落PCR：含有目标基因载体大小：电泳检测酶切鉴定：目标基因插入及插入方向测序验证：目标基因的序列准确无误，阅读框通读。第四十三张，PPT共六十一页，创作于2022年6月6.2.

20、3 表达载体构建表达载体设计目标基因的定位克隆DNA重组筛选与鉴定 这里重点介绍表达载体的设计（构建过程与技术与目标基因克隆相似）。第四十四张，PPT共六十一页，创作于2022年6月表达载体的设计表达载体概念：在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入外源基因表达盒所构成。外源基因表达盒（操纵子模型）：启动子目标基因终止子第四十五张，PPT共六十一页，创作于2022年6月大肠杆菌lac启动子受环腺苷酸（cAMP）激活蛋白（CAP）的正调控和lac 负调控。CAP-cAMP复合物与操纵子结合，促进了RNA聚合酶与启动子结合，开启基因转录。lac 形成四聚体，与操纵基因结合，阻止转录起始。lac操纵子

21、的诱导物：IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）等乳糖类似物IPTG与lac 结合，解除了lac 的阻遏作用，激活基因转录。LacCAP-BSPromoterOperatorlacZlacYlacATerminatorRNA聚合酶lac糖苷酶，转移酶，透过酶阻遏蛋白第四十六张，PPT共六十一页，创作于2022年6月启动子功能：启动子与RNA聚合酶结合，起始基因转录最关键的元件：决定着表达的类型和产量序列特点：-35位，TTGACA序列；-10位，TATAAT序列；强启动子：UP元件第四十七张，PPT共六十一页，创作于2022年6月终止密码设计UAA/TAA，UAG/TAG，UGA/TGATAA：

22、真核和原核，广泛使用，高效TGA：高效过量表达时，能被tRNAtrp通读。TGAT可阻止通读。为了防止通读，在终止密码子之后的加强序列，成为四联终止密码子：TAATTAAGTAAA和TAAC第四十八张，PPT共六十一页，创作于2022年6月6.2.4 基因工程菌的建立过程： 适宜宿主菌的转化 筛选鉴定，遗传稳定性等目标： 获得质粒能稳定遗传、基因能高效和定向表达的载体，确保药物的生物活性。第四十九张，PPT共六十一页，创作于2022年6月表达筛选与产物鉴定不同菌种的表达筛选诱导表达时间和诱导强度的筛选产物存在形式和存在场所的鉴定 -胞外，周质，胞内；包涵体，可溶性蛋白表达产物结构与活性鉴定 -

23、电泳，SDS，等电点电泳 -免疫杂交，末端测序，质谱分析 -分析与目标产物的同一性第五十张，PPT共六十一页，创作于2022年6月1、不同菌株的表达能力不同同一菌种的不同转化细胞之间存在表达差异。对宿主菌必需进行筛选目的：获得最大表达量的菌种对转化细胞的对数期进行诱导，收集菌体，裂解，提取总蛋白质，进行SDS电泳。第五十一张，PPT共六十一页，创作于2022年6月2、不同诱导时间下的表达在不同诱导时间，取样，电泳随着诱导时间的延长，表达量增加第五十二张，PPT共六十一页，创作于2022年6月3、蛋白质存在形式分析大肠杆菌M109结果： 在上清，可溶性蛋白质可溶性表达第五十三张，PPT共六十一页，创作于2022年6月大肠杆菌DH5结果：蛋白质存在于沉淀中，以包涵体形式表达第五十四张，PPT共六十一页，创作于2022年6月6.2.5 工程菌构建的质量控制为了确保工程菌构建的有效性，必须遵循GMP及其