利用参考资料不同的方法筛选和鉴定转化子

1、生物工程上游技术综合设计实验利用不同的方法筛选和鉴定转化子生命科学学院生扬工程09级1班同纽成员:指导教师:摘要：通过转化子郦选、苗落直接PCR.重组质粒大小鉴定、重组质粒酶切鉴定、磴纽质粒 的进一步PCR鉴定等一系列步骤，我组成功筛选并鉴定了含有pET32-CaM5转化子的两个葡 落，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。关键词：转化子；筛选：鉴定；PCR;凝胶电泳引言：在质粒载体上进行克隆时，由于量少，连接产物没有也不可能再经过分离纯化而获得 纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体.载体与目的片段连接而成的目的重 组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同吋，细葡（宿

2、主）的转化效率极 低，即转化实验后绝大部分细菌（宿主）是没有被转化的，因此有必要对转化产物进行筛选 和鉴定。首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。然后，通过菌落直接PCR从转 化子中弼选出候选转基因生物。灵后，从候选莹组子中提取质粒。一. 使用仪器、材料1、材料实验九装备好的转化产物：含pET32-CaM5或pET32的E co DH5 u菌株（R , M , Amp ）2、设备用具PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒 温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、cppendorf管（1.5mL离心管）等。3、主要试剂大肠杆菌培养试剂、质粒提取试剂.

3、酶切试剂、PCR反应试剂、电泳试剂以及其他 常规试剂。实验步骤1、转化子筛选（已做）（1）每组连接反应转化原液取100 u L用无菌玻璃棒均匀涂布于筛选培养基上,37C 下培养半小时以上，直至液体被完全吸收。（2）倒置平板于37C继续培养1216h，平板上所长出的单菌落即为转化子。因为不 带质粒的细胞无Amp抗性，不能在含有Amp的培养基时成活。2、菌落直接PCR 用无菌牙签分别挑取4个白色转化子菌落和一个已知的pET32- CaM5菌落,先在编 好号的5支PCR反应管中的底部分别涂搽，然后点在新的含有Amp的筛选平板上, 在其背面编号，置37C过夜后保存于4C。在PCR反应管中加入PCR反应

4、混合液, 进行PCR反应。PCR反应混合液的配制（50 u 1）lOxPCR buffer5uldNTP mixture4 u 1前向引物（Pl）2ul2ul0.5 u 136.5 u 1反向引物（P2） rTaq 酶灭菌蒸憾水（注：dNTP mixtures： dATR dTTR dGTP. dCTP 各 2.5mM前向引物（lOuM）为：5 -CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3，反向引物（lOuM）为:5 -AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3）所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，然后分为5份，每份10

5、ul加 入上述5支PCR反应管。为了防I上反应混合液蒸发，每份可添加20卩1矿物油覆盖。（3）PCR仪的参数设置94C94 C62 C72 C72 C2 min30sec30sec30sec5 min（4）琼脂糖凝胶电泳检测反应结朿后，取5 u 1 PCR产品，加入21 6或10 x loading buffer,混匀后点样. 电泳15min,观察产品的大小。3、-重组质粒大小鉴定（1）用无菌牙签从上述新的筛选平板上挑取PCR反应阳性菌落、，接种于含 Amp 50 u g/mL的5mLLB液体培养基中，37C下振荡培养12h。（2）配制试剂：溶液 I： 50mM 葡萄糖，lOmMEDTA, 2

6、5 mMTris-HCl （pH8.0）,用前加溶菌酶 4mg/L；溶液 II： NaOH 溶液（内含 1 %SDS）： 0.2 M：溶液 III （pH4.8） : 60 mL 5 mol/L 醋酸钾,11.5 mL冰醋酸，2&5 mL H2O：饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）氯仿TE 缓冲液（pH8.0） : lOmMTris-HCb 1 mMEDTA,其中含 RNA 酶（RNascA）:20 pg/ml醋酸鞍（pH75&0） :75 mol/L异丙醇；70%乙醇：无水乙醇。（3）吸取1.4 ml菌液至l5ml离心管中。（4）离心（8 OOOrpm，分钟）,弃上淸液。（如想提取多一点

7、DNA,再吸取1.4ml菌 液至同一离心管中，离心，弃上淸液）（5）加入150ML溶液I ,用旋涡振荡器充分悬浮菌体。（6）加入200 pL溶液II,加盖后温和颠倒56次，直至呈透明状。此步骤在5分钟 内完成。（7）加入150 pL预冷的溶液【II,加盖后反复颠倒混匀，直至岀现白色絮状沉淀，冰 浴5分钟。（8）离心（14OOOrpm, 10分钟,4 C）,移取上淸液于另一干净离心管。（9）向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）,振荡混匀抽提，离心（14 000 rpm, 5分钟），溶液将出现分层。（10）移取上层水相溶液（约450pL）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀

8、 抽提，离心（14 000 rpm, 5分钟），溶液将岀现分层。（11）移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和2 倍体积无水乙醇混匀，冰浴30分钟。（12）离心（14 000rpm, 10分钟,4C）,倒掉上淸液。（13）力n 0.5 ml预冷的70%洒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心5分钟，倒掉上淸 液。（14）真空抽干或室温自然干燥（15）力n 30M0pLTE缓冲液使DNA完全溶解,室温放置10分钟，降解RNA杂质, 琼脂糖凝胶电泳或-20C保存备用。（16）琼脂糖凝胶电泳（1%）：称取0.5g琼脂糖粉末，加入50ml 0.5倍TBE溶液, 加热熔化，稍

9、降温后，加入5pL澳化乙锭（EB）,混匀，制备凝胶板，冷却后 备用。（17）每位同学各取5pL质粒DNA加入lpL6Xloading buffer混匀，进行点样。（18）电泳条件：120v, 25分钟：电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实 验结果，并拍照记录。（19）以pGEM-T作对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移速度较慢。4、-重组质粒酶切鉴定利用CaM5片段上的特异酶切位点旳汕11来检验，该片段上两个位点间的DNA 是 219bp.（1）酶切反应酶切反应液的配制：Wwdlll1 ul10XM buffer2ul质粒5ulddH2012ul酶切反应条件：37C水浴23小时。（2）

10、电泳检测反应结束后，向反应液中加入2.2 u 1 10Xloading buffer,混匀以停止酶切反应，所 有22.2 U 1样品均点在同一个点样孔中。电泳条件：120V.45分钟左右。电泳后，观察 酶切结果是否与预期的相符，即观察产品的大小。5、重组质粒的进一步PCR鉴定（1） PCR反应混合液的配制（10 P1）10 x PCR bufferl.OuldNTP mixture0.8 ul前向引物（Pl）0.4 ul反向引物（P2）0.4 u I质粒0.2 ulrTaq 酶0.1 ul火菌蒸懈水7.1 ul(注：dNTP mixtures： dATR dTTR dGTP. dCTP 各 2

11、.5mM前向引物(lOuM)为:5 -CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3 反向引物(lOuM)为：5 AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3)所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，可 添加20 ul矿物油覆盖。94C2 min94 C30sec35 cycles 4 62 C30secI 72 C30sec72 C5 min琼脂糖凝胶电泳检测(2) PCR仪的参数设置加入1 ul 6或10 x loading buffer混匀后点样,反应结束后，取5 u 1 PCR产品, 电泳15min

12、,观察产品的大小。三、结果与分析1、菌落直接PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1。marker 图1菌落直接PCR的琼脂糖凝胶电泳检测结果图1中，为已知的pET32CaM5菌落质粒，对比可知，、 为阳性转化子，为阴性转化子，因此，四个菌落(、)中有3 个(、)呈阳性。再对比marker可知，、与的窄条带大 小均为6130bp,与pET32质粒大小相符：宽条带大小均为219bp,与CaM5 ) 段大小相符。综上初步判断，、所代表的菌落为所需鉴泄的转化子， 即含pET32CaM5的菌落。2、重组质粒大小鉴定琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2. *77图2重组质粒大小鉴定的琼脂糖凝胶电泳检测结果 marke

13、r图2中，对比marker可知，、条带大小均为6130bp,符 合pET32-CaM5质粒的理论大小，表明、两个菌落都是成功 的pET32CaM5转化子。3、重组质粒酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3的、。markerI 1【 图3重组质粒酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳检测结果图3中，、均岀现了两条同步的条带，对比marker可知，在上而 的条带大小约为6130bp,在下面（较暗）的条带大小约为219bp,与预期 的相符，表明、两个菌落都是成功的pET32-CaM5转化子，至此，可 认定已筛选出目的重组子。4、重组质粒的进一步PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3的I、1【。图3中，I、II均有条

14、带，且大小均为443bp,与预期的相符，进一步表明 所对应的.两个菌落都是成功的pET32-CaM5转化子。四、结论本实验中，首先通过抗生素抗性从转化后代中筛选出编号为、的含 转化子pET32-CaM5的菌落：然后通过菌落直接PCR从转化子中筛选岀候选转基因 生物、：最后从候选重组子、中提取质粒进行重组质粒大小鉴定及重组 质粒酶切鉴左，此两个鉴左均表明、两个菌落都是成功的pET32-CaM5转化子。 另外，为进一步检验转化已成功，对重组质粒进一步进行PCR鉴左，结果亦进一步表 明、两个菌落都是成功的pET32-CaM5转化子。五、问题与讨论1、做实验时应有团队精神，注意分工合作，发挥最大效率。

15、例如可让一个同学做辅助 性步骤（如先配好要用的液、调好移液枪等），另一个同学专心做主要的步骤，这 样可节省许多时间。2、做实验前应充分准备，了解实验原理，弄淸每一个步骤，为实验能有条不紊地进行 打好基础。例如有的同学因为没有弄淸每一个步骤是怎样的，最终要看我组的预习 报告，否则不知道怎样具体进行实验，可见实验前的充分准备是十分重要的。3、实验时要细心，注意不要加错试剂、防止细菌污染样品、调准仪器等，否则实验将 不能顺利进行甚至失败。例如重组质粒酶切鉴泄时由于粗心，我把10 x loading buffer 当成10XM buffer用，结果水浴2小时多后才发现，于是不得不重做。4、应懂得利用身边的各种资源。例如本次实验由学生自行设il，难度比较大，但