《《细胞工程实验》》课程教学大纲（本科）

1、细胞工程实验Cell Engineering Experiment课程编号：09410083课程教学总学时：48实验总学时：16总学分：2.5先修课程：生物化学、细胞生物学、分子生物学、遗传学等适用专业：生物技术一、目的与任务细胞工程实验是生物技术本科专业的主要实验内容之一，主要训练学生掌握细 胞、组织培养的基本技能和操作要领，实验方法立足于学科的专业基础和常规生物 学实验室的条件，将细胞工程课程的理论知识、一般实验技能和科学研究的初 步方法融为一体，培养学生理论联系实际、独立思考及实践动手能力。二、实验教学的基本要求本实验教学要求学生掌握细胞工程学研究的主要方法、基本技能。在今后工作 中能独

2、立进行包括实验室主要仪器设备的操作、培养基制备、灭菌消毒技术、细胞 原代培养、细胞传代培养、植物细胞培养等研究。三、本课程开设的实验项目0.4% B-筑基乙醇：1ml B-筑基乙醇加入定容至250 ml的提取液中。序号实验项目实验内容提要学时实验类型1细胞工程实验室常用 仪器设备及培养用具 的清洗和灭菌学习倒置显微镜、超净工作台、培养箱、灭菌 锅等设备的使用方法；学习培养器械的清洗、 包装、消毒和灭菌方法。2先期2细胞培养主要溶液的 配制学习缓冲液、培养基的配置、灭菌和分装方法2先期3烟草（番茄、拟南芥 等）种子培养无菌苗学习通过筛选培养基初步鉴定转基因植物种子 或者培养后续试验的材料等4综合

3、性4植物细胞的悬浮培养学习植物细胞提取及培养方法4综合性5动物细胞原代培养学习动物细胞提取及原代培养方法4综合性6动物细胞融合学习诱导细胞融合的原理及掌握细胞融合技术4综合性7原生质体的制备学习掌握植物细胞原生质体的分离和纯化方法4综合性8原生质体转化学习诱导植物体细胞杂交的技术方法之一4综合性9烟草（西洋参等）发 状根培养学习发状根诱导及培养技术4综合性其中，EDTA: 0.5mol/L,pH 8.0,注意：不可回调 pH!1L167 g EDTA 定容 60ml 重蒸水中（先力口 45ml ddthO）（或 186.1g EDTA 力口入 800ml 水中,最 终定容至1L）,在磁力搅拌器

4、上剧烈搅拌。用NaOH调pH至8.0（约1.2g. NaOH颗粒定容至60ml （约20g.NaOH颗粒，定容至1L）。高压灭菌。（2）、提取过程1）、取叶片10mg放入1.5离心管中，适量液氮加入管中，用研头研磨。2）、每管加入预热的300ul提取液，轻轻混匀。3）、将样品于65度保持15-30分钟，期间摇3次。4）、冷至室温，加入200ul氯仿：异戊醇（24:1）,混匀。5）、12000rpm 离心 10 分钟。6）、取上清，加入250ul异丙醇，轻轻混匀。7）、12000rpm 离心 10 分钟。8）、倒掉上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次。9）、真空干燥或室温干燥。10）、用 50ulTE

5、 或 ddHzO 溶解。2、转基因植株的PCR筛选用CTAB微量法提取转基因植株叶片中的总DNA,以此为模板，用相关的引物进行PCR。 正向筛选引物是引物H和35s （或其它启动子）引物，反向筛选引物是引物I和35s引物，反应 体系如下： TOC o 1-5 h z PCR buffer (pl)2.5MgCh (pl)2dNTP (pl)1弓I物i或n(|j)i35S 等(pl)1DNA (pl)1TaqE (pl)0.25DdH2O (pl)16.5Total (pl)25.0反应程序如下：94c预变性5 min94变性xxsXX退火XX s30或35个循环xx延伸XX s 72后延伸10

6、 min取PCR产物IO3,进行琼脂糖凝胶电泳检测。（四）作业1、将本次实验整理成实验报告2、基因组小量法提取、外源基因检测还有那些方法？四、实验成绩的考核与评定办法以实验过程和实验报告为考核依据，成绩分优、良、中、及格和不及格五等, 占总成绩的15%。2017年8月24日10转基因植（动）物基 因转入鉴定学习转基因植物外源基因转入鉴定的方法4验证性试验L烟草（番茄、拟南芥等）种子培养无菌苗（一）、实验原理及目的要求种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的为成熟种子的无菌培养。利用种子 培养可以使远缘杂交产生的杂种败育种子，正常萌发产生第二代植株；可以打破种子休眠，特别 对一些休眠期

7、长的植物，可以作为大量生产试管苗的好材料；可以通过筛选培养基初步鉴定转基 因植物种子；或者做为后续试验的材料等等。通过本次实验，要求学生学习种子培养的基本方法 和步骤，掌握种子的消毒灭菌和培养方法。（二）、材料、仪器与试剂1、烟草（或番茄、拟南芥）种子等。2、三角瓶、培养瓶、镶子、封口塑料、pH计、高压灭菌锅、光照培养箱、超净工作台等。3、MS固体培养基（或筛选培养基）、70%酒精、次氯酸钠、（0.1%的Tween）、无菌水等。（三）、方法步骤分组配置培养基（培养基配置详见试验指导说明），接种单独完成。.选取饱满完好的植物种子；以下步骤均在超净工作台上进行。.将选好的植物种子放入100mL的三

8、角瓶中，加入70%的酒精浸泡不超过Imin ；.沥去酒精后，加入15%的次氯酸钠消毒10分钟（因品种而异，一般在8-15min）；.沥去消毒液后，用无菌水冲洗34次。.沥干水份，倒入灭菌滤纸中吸水，将种子均匀植入MS固体培养基中（转基因种子植入筛选 培养基中），24,光强15001X,光照16h/d。（四）、作业L将本次实验过程及结果整理成实验报告2.在种子培养的无菌操作过程中需要注意哪些？试验2.植物细胞的悬浮培养（一）实验原理及目的要求植物细胞的悬浮培养是将植物游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养 基中进行培养。将外植体离体培养获得的疏松型的愈伤组织悬浮在液体培养基中，并在

9、摇床上震 荡培养一段时间后，可形成分散悬浮培养物，将其调节到适宜密度进行培养。如从植物器官或组 织开始建立细胞悬浮培养体系，包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。对于 多数悬浮培养物,细胞在培养到18-25天时达到最大密度。这项实验技术广泛应用于细胞的遗传、 凋亡等研究工作，及基因工程在植物细胞水平上的操作等。通过本次试验，学习并掌握植物细胞 悬浮培养的方法和技术。（二）、材料、仪器与试剂1、植物（烟草、拟南芥、番茄等）愈伤组织2、超净工作台、高压灭菌锅、旋转式摇床、水浴锅、倒置显微镜、pH计、移液器、恒温培养室 等。3、MS培养基、植物激素如2,4-D、酚藏红花等。（三）、方法

10、步骤分组配置培养基（培养基配置详见试验指导说明），操作培养单独完成。1、愈伤组织的诱导和获得以植物胚小叶（或利用实验1的材料）为外植体，培养在含激素的MS培养基上，诱导愈伤组织。 2、在无菌条件下，用镶子将愈伤组织取出来，放在含有液体培养基（如MS+10. Omg/L 2,4-D） 的三角瓶中并轻轻夹碎，每瓶接种1-1. 5g愈伤组织。将已接种的三角瓶置于摇床上，在约 100r/min, 25-28条件下振荡培养。3、经6T0天左右培养后，向培养瓶中加新鲜培养基10ml继续培养，也可进行继代培养。4、悬浮培养物的过滤：继代培养几代后，培养液中应主要由单细胞和小细胞团组成。若仍有较 大的细胞团，

11、可用适当孔径的金属网筛过滤，再将过滤后的悬浮细胞继续培养。5、制作细胞生长动态曲线：（细胞计数：取一定体积的细胞悬液，稀释2倍混匀后，取一滴悬液 置入血细胞计数板上计数）在继代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称 量细胞的鲜重，以鲜重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞鲜重生长曲线。上述方法干重法 也可。每个2天取样一次，共5次以上，每个样品重复3次，整个生长曲线试验期间，不再往培 养瓶中替换新鲜培养液。6、细胞活力测定：在培养不同阶段，吸取一滴细胞悬浮液，滴一滴0.1%的酚藏花红溶液（用培 养基配置）染色，在显微镜下观察。活细胞均不染色，死细胞被染成红色。活用0.设荧光双醋

12、 酸酯溶液染色，活细胞在紫外光诱发下显示蓝绿色荧光。（四）作业1、良好的细胞悬浮培养体系应具备什么特征？2、试验操作的注意事项？试验3、动物细胞原代培养（表皮角质细胞等）（一）、实验原理及目的要求动物细胞培养是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术。大多数 哺乳动物必须附着在带适量正电荷的固体或半固体表面才能生长，当细胞布满表面后即停止生 长。动物细胞对营养要求高，培养基可分为天然、合成、无血清培养基3种，常用的包括：MEM、 DMEM. RPMH640、F12、M199等。接种组织块直接长出单层细胞或将组织分散成单个细胞进行培 养，在首次继代前的培养称为原代培养，一般持续

13、上4周。动物细胞培养可以获得大量细胞作为研究材料，如研究细胞分化、药物测试等，同时 也是 现代生物制药的重要技术之一，可以利用动物细胞制备相关药用产品，尤其可表达原核细胞所不 能生产的药用物质。原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。通过本实验学习掌握消化 培养法或组织块培养法的细胞原代培养方法。（二）、材料、仪器与试剂1、1-2天新生大鼠。2、C02培养箱（37）、培养皿、培养瓶、吸管、眼科剪刀、镶子、倒置显微镜、超净工作台、 离心机、光学显微镜等。3、KC1、K2Hp0八青霉素、链霉素、胎牛血清、胰岛素、转铁蛋白、胰蛋白酶等。（三）、实验步骤1、预处理：将刚出生不久的大白鼠颈椎致死，置

14、75%乙醇泡23s,再用碘酒消毒，于超净工作 台内取背部皮肤，用剪刀仔细剪去皮下脂肪组织，剪成5mmX 5mm小块。2、消化培养法：D-Hank s液洗3次，表皮面朝上浸于2. 5g/L中性蛋白酶（dispase）中，4 冰箱中过夜20h后，用两把眼科镶子将表皮从真皮上撕下，剪成碎片。再用0.25%胰蛋白酶和 0. 01%EDTA按1:1在37c条件下消化lOmin,用含血清的DM液终止消化；经200目滤网过滤，以1000r/min离心5min,弃去上清液，DM液洗3次，收集细胞；加入DF培养液，混匀，台盼蓝染色计数，细胞活力大于85%。计数后制成单细胞悬液，按1.0 XI。,密度接种于一次性

15、塑料培养皿中培养。37、56%CO2培养条件下培养。36h后换液，以 后每3天换1次液。倒置显微镜下观察角质细胞增殖。3、组织块培养法：将去除真皮后的表皮剪成13mm3小片，贴附于培养瓶底面。翻转瓶底朝上, 将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。37静置35h,轻轻翻转培养瓶，使表皮组织浸入 培养液中（勿漂起），37。继续培养。（四）、作业1、观察和记录原代细胞的形态、细胞贴壁时间、增殖时间。2、为什么可能会有成纤维细胞的污染？3、分析中性蛋白酶在去除成纤维细胞污染中的作用。试验4、动物细胞融合（一）、实验原理及目的要求生物细胞在诱导剂作用下，相互靠近的细胞发生凝集，随后在质膜接触处发生质膜成

16、分的一 系列变化，主要是某些化学键的断裂与重排，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核细胞（称 同核体或异核体）。通过实验要求掌握PEG等诱导细胞融合的原理，初步掌握细胞融合技术。（二）、材料、仪器与试剂1、一龄公鸡静脉血。2、显微镜、离心机、天平、注射器等。3、Alsever 溶液、GKN 溶液、0. 85%生理盐水、50%PEG4000 溶液、Janus green 染液等。（三）、实验步骤1、试剂的配制：Alsever溶液:葡萄糖2.05g,柠檬酸钠0. 80g, NaCl 0. 42g,溶于100ml双蒸水中。CKN 溶液：NaCl 8g, KC1 0. 4g, Na2HPO4 2H2

17、O 1. 77g, NaH2PO4 H2O 0. 69g,葡萄糖 2g,酚红 0. 01g, 溶于1000ml双蒸水中。50%PEG溶液：称取一定量的PEG （Mr=4000）放入烧杯中，沸水浴加热，使之溶化，待冷却至50 时，加入等体积预热至50c的CKN溶液，混匀，置37备用。2、在公鸡翼下静脉抽取2nli鸡血，加入盛有8nli的Alsever溶液中，使血液与Alsever溶液的 比例达1:4,混匀后可在冰箱中存放一周。3、取此贮存鸡血1ml加入4ml 0.85%生理盐水，充分混匀，800r/min离心3min,弃去上清，重 复上述条件离心2次。最后弃去上清，加CKN溶液4ml,离心。4、

18、弃去上清，加CKN液，制成10%细胞悬液。5、取上述细胞悬液以血细胞计数器计数，用CKN液将其安排为I X IO,个/m。6、取以上细胞悬液1ml于离心管中，放入37水浴中预热。同时将50%PEG溶液预热20min。7、20min后，将0.5ml50%PEG溶液逐滴沿离心管壁加入到1ml细胞悬液中，边加边摇匀，然后 放入37水浴中保温20mino8、20min后，加入CKN溶液至8ml,静置于水浴中20min左右。9、800r/min离心3min,弃去上清,加CKN溶液再离心一次。10、弃去上清，加CKN溶液少许，混匀，取少量悬浮于载玻片上，加入Janus green染液，用牙 签混匀，3mi

19、n盖上盖玻片，观察细胞融合情况。11、计算融合率，融合率二（视野内发生融合的细胞核总数/视野内所有细胞核总数）X100%o（四）、作业1、实验过程中的注意事项？2、进行异种细胞的融合有什么意义？实验5、原生质体的制备（一）、实验原理及目的要求原生质体是去除细胞壁后裸露的球形细胞。原生质体虽然没有细胞壁，但仍能进行基本的生 命活动，同时在离体培养条件下可以再生细胞壁。原生质体是进行植物细胞融合、诱变育种的原 料，在植物新品种培育方面具有重要价值，同时也是基础研究的重要材料。植物细胞壁主要成分为纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质。原生质体制备必须采用适 当方法去除细胞壁。选择制备原生质体的材料非

20、常重要。理论上，植物的各个器官及其愈伤组织 和悬浮细胞都可以作为制备原生质体的材料。但是，材料来源部位、季节、植物年龄、生理与营 养状况等都会影响原生质体制备的效率。一般选用生长旺盛、生命力强的植物组织作为材料。应 根据不同种类的细胞选择合适的生物酶，还应考虑原材料。酶不同浓度或不同酶的组合、酶解时 间、温度、酸碱度等因素。通过实验学习掌握植物细胞原生质体的分离和纯化方法。了解原生质体活性培养和细胞壁再 生的分析方法。（二）、材料、仪器与试剂1、新鲜烟草植株叶片（拟南芥叶片、菠菜叶片）等。2、光照培养箱、摇床、离心机、光学显微镜、超净工作台、培养皿、离心管、载玻片、200目 筛网、解剖刀、滤纸

21、、枪头、刀片、pH计、电子天平、200目不锈钢过滤网。3、酶解液、洗涤液、0.02%二乙基荧光素（FDA）、70%乙醇、0. 15% NaClO溶液、0. 2mol/L CaCl2 溶液、0.1%酚藏花红溶液。（三）、实验步骤1、酶解液、洗涤液等配置：详见实验指导2、原生质体酶解制备：取充分展开的烟草叶片，用自来水冲洗干净；在超净工作台上将烟草叶片在70%无水乙醇洗涤10s,在0. 5% NaClO溶液中浸泡lOmin灭菌 （中间摇动几次）。取出叶片，无菌蒸僧水漂洗5次；将叶片放入培养皿中，吸去水分，叶背面朝上，用无菌镶子小心撕去下表皮，或用解剖刀将 叶片切成0.5nmi宽的小条；另取1个培养

22、皿，加入酶解液10ml,放叶片约2g,浸泡。在28保温3-6小时，中间轻轻 摇动2-3次。3、原生质体纯化待酶解到足够多的原生质体后，将酶解液倒入200目的过滤筛中，滤掉未酶解的叶片碎片，将含有原生质体的酶解液收集到离心管中，500rpm离心5min,去掉酶解液；加入W5漂洗离心管底部的原生质体，300rpm离心5min,去掉W5；重复加入W5漂洗一遍，300rpm离心5min,去掉W5；加入适量的MMgo4、原生质体活性分析取1滴原生质体悬液于载玻片上，加入相同体积的0.02%FDA稀释液，静置2-5min,于荧光 显微镜下观察，发绿色荧光的为有活力的原生质体，没有产生荧光的原生质体无活力；

23、也可取一滴原生质体提取液在载玻片上，加入相同体积的0.1%酚藏花红溶液，静止2min后, 显微镜观察，有活力的原生质体均不着色，死亡无活力的原生质体染成红色；计算原生质体的活力：原生质体的活力二活的的原生质体/总原生质体X100%。5、结果分析显微镜下计算获得的原生质体浓度，并观察原生质体形态；计算有活力的原生质体的比例。（四）、作业.要获得数量多、生命力强的原生质体，你认为在实验中应注意哪些问题?.纯化原生质体的方法有哪些？试验6、原生质体转化（一）、实验原理及目的不同种植物的原生质体在人工诱导条件下融合产生杂种细胞，经过培养可再生细胞壁，分裂 形成愈伤组织，进而分化产生杂种植物。由于进行融

24、合的原生质体来自体细胞，因此称之为体细 胞杂交。原生质体融合能使有性杂交不亲和的植物种间进行广泛的遗传重组，因而在农业育种上 具有巨大的潜力。聚乙二醇（PEG）是一种多聚化合物，分子式为HOH2c（CH20cH2）nCH2OH,常用的PEG平 均相对分子质量为200.20000,相对分子质量1000以下者为液体，1000以上者为固体。PEG促进细胞融合的具体机制尚不完全清楚，普遍认为聚乙二醇分子能改变细胞膜结构， 使两细胞接触点处质膜的脂质分子发生扰动和重组，从而使细胞发生融合。可能的原因包括：（1） PEG分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、糖类分子形成氢键， 在相邻

25、的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质体接触。当PEG分子被洗脱时，膜电荷发生 紊乱而重新分配。一种原生质体上带正电荷的基团可能与另外一个原生质体中带负电的基团相 连，导致原生质体融合。（2） PEG还可以改变膜的物理和化学性质，增加类脂膜的流动性，使 原生质体的核、细胞器发生融合成为可能，从而促进原生质体融合。细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞（包 括已融合的细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示。通过实验掌握聚乙二醇（PEG）诱导植物体细胞杂交的技术方法。（二）、材料、仪器与试剂1、烟草叶片、胡萝卜悬浮细胞系等。2、光照培养箱、摇床、离心机、光学

26、显微镜、超净工作台、培养皿、离心管、载玻片、200目 筛网、解剖刀、滤纸、枪头、刀片、pH计、电子天平、200目不锈钢过滤网。3、酸解液、洗涤液、0.l%2-N-吗啡咻乙磺酸钠或三羟甲基氨基甲烷溶液，20%蔗糖，pH6.0、0.02% 二乙基荧光素（FDA）、20%, 25%蔗糖溶液、无菌蒸储水、70%乙醇、0.1%升汞溶液、0.2mol/L CaC12溶液、0.1%酚藏花红溶液、0.01%荧光增白剂溶液。（三”实验步骤1、烟草原生质体制备或胡萝卜原生质体制备：方法见前面试验。2、细胞融合将收集的两种不同材料的原生质体分别悬浮在0.16mol/L CaCb 2H2O（pH5.8-6.2）,原生

27、质体 密度在2义105的1左右。1）将两种原生质体悬液等量混合。2）用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为60mm的培养皿中，每皿加7-8滴，每滴 约。.1mL静置lOmin,使原生质体在皿底形成一薄层。需要3-5个培养皿的重复实验。3）用刻度吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置10-15mino此时可取 一个培养皿在倒置显微镜下观察原生质体间的粘连。4）用刻度吸管向原生质体液慢慢加入高pH （10.5）、高钙离子（例如0.16mol/L）溶液。第 一次加O.5ml,第二次1mL第三、四次各2mL每次间隔5min。5）将培养皿稍微倾斜，吸去上清液，再缓缓加入4ml高pH、高

28、Ca2+溶液。5min后再倾斜 培养皿，吸去上清液（注意：吸去上清液时勿使原生质体漂浮起来）。6）用DPD培养基按照上面方法洗涤两次。7）每个培养皿中加2mlDPD培养基，轻轻摇动培养皿。8）用蜡膜密封培养皿。置26下进行24h暗培养，然后转到弱光条件下培养。3、结果分析1）、在倒置显微镜下观察异源原生质体的融合情况。在培养3天以内，可根据双亲原生质体 的形态特征来鉴别融合体。因为来自叶肉组织的原生质体具有明显绿色叶绿体，而来自培养细胞 的原生质体无色。2）、绘图表示所观察到的融合细胞，统计异源融合的频率。（四）作业.怎样区分融合细胞与没用融合的细胞？.分析在融合处理后可能存在的细胞类型。试验

29、7、烟草（西洋参等）发状根培养（一）、实验原理及目的发状根（毛状根）是由发根农杆菌含有的Ri质粒引起的。发状根属于激素自养型，具有有 效成分含量高、生理生化和遗传稳定等特点，在植物次生代谢产物生产方面具有极大的应用潜力。 此外，为了提高烟草（人参）的烟碱（人参皂甘）含量，利用发根农杆菌遗传转化和人工染色体 加倍技术，可进行烟草等毛状根及其多倍体诱导、植株再生、烟碱等含量测定。通过本次实验, 要求学生学习掌握发状根诱导及培养技术。（二）、材料、仪器与试剂1、离心机、恒温摇床、高压灭菌锅、超净工作台等。.容量瓶、量筒、锥形瓶、培养皿、移液枪等。.牛肉浸膏、胰蛋白陈、酵母提取物、MgSO47H2。、发根农杆菌、无菌水等。（三）、实验步骤1、无菌苗的培养：前期试验已做。2、发根农杆菌侵染菌液的制备：超低温冰箱中长期保存的菌种，在YEP固体培养基（含有100mg/L卡那霉素）中划线培养 2-3天后，挑取农杆菌单菌落于lOmlYEP液体培养基中，28cl80rpm暗处振荡培养约18h,取 lOOul活化的菌液加入50mlYEP液体培养基中进行二次活化，培养至OD600,将活化的菌液以 3000rpm