仪器分析教学课件之色谱分析概论

1、第十六章 色谱分析概论（Introduction to Chromatographic Analysis）第一节 色谱法概述 一、色谱法的由来 11906年由俄国植物学家 Tsweet 创立植物色素分离。next 2现在：一种重要的分离、分析技术分离混合物各组分并加以分析 固定相除了固体，还可以是液体。 流动相液体或气体。 色谱柱各种材质和尺寸。 被分离组分不再仅局限于有色物质。next固定相CaCO3颗粒流动相石油醚 色带back二、色谱法定义、实质和目的定义：利用物质的物理化学性质建立的分离分析方法。实质：分离。目的：定性分析或定量分析。三、分类：1按两相分子的聚集状态分类：流动相 固定相

2、 类型液体 固体 液-固色谱液体 液体 液-液色谱液相色谱（LC）气体 固体 气-固色谱气体 液体 气-液色谱气相色谱（GC）超临界流体 超临界流体色谱（SFC）2按固定相的固定方式分类： 平面色谱（Planar chromatography） 纸色谱 薄层色谱 高分子薄膜色谱 柱色谱（Column chromatography） 填充柱色谱 毛细管柱色谱 毛细管电泳法（Capillary electrophoresis）3按分离机制分类： 分配色谱：利用分配系数的不同。（Partition chromatography） 吸附色谱：利用物理吸附性能的差异。（Adsorption chroma

3、tography） 离子交换色谱：利用离子交换原理。（Ion exchange chromatography） 空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同。（Steric exclusion chromatography） 毛细管电泳法：利用组分电泳速度差异。（Capillary electrophoresis）色谱法简单分类：四、色谱法的特点优点：“三高”、“一快”、“一广”缺点： 高选择性：可将性质相似的组分分开； 高效能：反复多次利用组分性质的差异产生很好分离效果； 高灵敏度：10-1110-13g，适于痕量分析； 分析速度快：几几十分钟完成分离一次可以测多种样品； 应用范围广：气体、液体、固体

4、物质以及化学衍生化再色 谱分离、分析。 对未知物分析的定性专属性差 需要与其他分析方法联用（GC-MS、LC-MS）一、色谱过程、分离原理及特点（一）色谱过程 指被分离组分在两相中的“分配”平衡过程。以吸附色谱为例:next 吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系数不同 差速迁移 分离第二节 色谱法的基本原理next分配系数的微小差异吸附能力的微小差异微小差异积累较大差异吸附能力弱的组分先流出； 吸附能力强的组分后流出。back（二）色谱分离原理 色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异。 平衡分配可以用分配系数和分配比来衡量。（三）色谱分离特点 1不同组分通过色谱柱时的迁移速

5、度不等提供了 分离的可能性。 2各组分沿柱子扩散分布峰宽不利于不同组 分分离。二、基本类型色谱法的分离机制基本概念：固定相（Stationary phase） 流动相（Mobile phase）（一）吸附色谱法（二）分配色谱法（三）离子交换色谱法（四）空间排阻色谱法（一）吸附色谱法要求： 固定相为吸附剂（硅胶或Al2O3），具表面活性吸附中心。分离机制：next吸附系数注：Ka与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质 及温度有关 next吸附平衡 Xm + nYaXa + nYm 分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心； 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离。吸附解吸再吸

6、附再解吸无数次洗脱分开。 back吸附色谱分离示意图（二）分配色谱法要求： 固定相：机械吸附在惰性载体上的液体； 流动相：必须与固定相不为互溶； 载体：惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应。分离机制 next 注：K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质 以及柱温有关 next分配系数分离机制 利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离。 连续萃取过程 back液液色谱分离示意图（三）离子交换色谱法要求：固定相：离子交换树脂； 流动相：水为溶剂的缓冲溶液； 被分离组分：离子型的有机物或无机物。分离机制 next选择性系数 RSO3-H+ + M+ RSO3-M+ + H+ 注：K

7、s与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离子交换树脂性质以及温度有关 next 固定离子可交换离子待测离子分离机制： 依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力） 不同而实现分离 。 back阳离子交换树脂交换示意图（四）空间排阻色谱法 要求： 固定相：多孔性凝胶； 流动相：水（凝胶过滤色谱）； 流动相：有机溶剂（凝胶渗透色谱 ）。 分离机制 next渗透系数 注：Kp 仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小， 与流动相的性质无关。 next 分离机制： 利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性 渗透实现分离。 back凝胶色谱分离示意图 结 论： 四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡

8、、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡。 K分别为吸附系数，分配系数，选择性系数和 渗透系数。 除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响。第三节 色谱法的历史与展望一、历史： 30年代 茨维特分离绿叶色素； 40年代 TLC、纸色谱； 50年代 GC出现使色谱具备分离和在线分析功能； 60年代 GC-MS出现有效弥补了色谱定性能力差的弱点； 70年代 HPLC出现使色谱分析范围进一步扩大。 二、发展与展望： 1新型固定相和检测器； 2新方法的研究； 3联用技术：GC-MS、HPLC-MS、CE-MS、GC-F

9、TIR、HPLC-NMR 4. 智能化、色谱专家系统：色谱柱的选择、评价、样品处理方法、分离条件的优化以及在线定性、定量及结果解析等。热力学理论：塔板理论平衡理论 动力学理论：速率理论Vander方程 基础第四节 色谱法的基本理论一、基本概念二、等温线三、塔板理论（平衡理论）四、速率理论理论基础一、基本概念1流出曲线和色谱峰2基线、噪音和漂移3保留值：色谱定性参数4色谱峰的区域宽度：色谱柱效参数 1流出曲线和色谱峰流出曲线（色谱图）：电信号强度随时间变化曲线。色谱峰：流出曲线上突起部分。不对称因子正常峰（对称）非正常峰 前峰 拖尾峰色谱峰fs在0.951.05之间fs小于0.95fs大于1.0

10、52基线、噪音和漂移 基线：当没有待测组分进入检测 器时，反映检测器噪音随 时间变化的曲线（稳定 平直直线）。噪音：仪器本身所固有的，以噪 音带表示（仪器越好，噪音越 小）。漂移：基线向某个方向稳定移动 （仪器未稳定造成）。3保留值：色谱定性参数保留时间tR：从进样开始到组分出现浓度极大点时 所需时间，即组分通过色谱柱所需要的时间。死时间t0 ：不被固定相溶解或吸附的组分的保留时 间（即组分在流动相中的所消耗的时间），或流 动相充满柱内空隙体积占据的空间所需要的时 间，又称流动相保留时间。调整保留时间tR：组分的保留时间与死时间之差值，即组分在固定相中滞留的时间。4色谱峰的区域宽度：色谱柱效参

11、数峰宽W：正态分布色谱曲线两拐点切线与基线相交 的截距。标准差：正态分布色谱曲线两拐点距离的一半； 对应0.607h 处峰宽的一半。 小，峰窄，柱效高。 除了用于衡量柱效，还可以计算峰面积。半峰宽W1/2：峰高一半处所对应的峰宽。基线tR0.607h色谱峰2tRt0W1/2hW信号时间 t保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极大点时 所消耗的流动相的体积。 死体积V0 ：不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流 动相的体积。（也指色谱柱中未被固定相所占据的空隙体积，即色谱柱的流动相体积，包括色谱仪中的管路、连接头的空间、以及进样器和检测器的空间）调整保留体积VR：保留体积与死体积之差，即组分停留在

12、固定相时所消耗流动相的体积。相对保留值r 2,1（选择性系数）：调整保留值之比。保留指数Ix ：指将待测物的保留行为换算成相当于正构烷烃的保留行为（已知范围内组分的定性参数）分离度：相临两组分间峰顶间距离与峰底宽平均值之 比（衡量色谱分离条件优劣的参数）。讨论5相平衡参数 容量因子k（容量比，分配比）：指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡时，在固定相与流动相中的质量比更易测定。分配系数K ：6. tR与K和k的关系 K、k 与保留值之间的关系公式推导：当组分的色谱峰最高点出现时，根据物料平衡：流出量柱内量 讨论： 色谱条件一定时，tR主要取决K或k的大小（色谱法基本的定性参数 ）。

13、K，tR ，组分后出柱 K=0，组分不保留 K ，组分完全保留二、等温线：指一定温度下，某组分在两相中分配达平衡时，在两相中的浓度关系曲线。1线性等温线（理想） 固定相表面活性吸附中心未达饱和，K一定，与溶质浓度无关。 固定相表面活性吸附中心不均，K不同先占据强吸附中心再占据弱吸附中心，K随着溶质浓度的增加而减小。 溶质与固定相作用，改变其表面性质，K随着溶质浓度的增加而增加。 等温线与色谱峰形状拖尾峰斜率=K2非线性等温线（2）凹形前沿峰（1）凸形拖尾峰前沿峰对称峰问题：色谱分离的基本理论基础： 热力学过程（组分和固定相的结构和性质）； 动力学过程（动力学因素与柱效的关系）； 色谱分离的评价

14、、色谱条件优化及数据库的建立。 色谱理论：塔板理论和速率理论。 组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制； 色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制。三、塔板理论 色谱柱为有若干塔板高度为H的塔板组成的填料塔；每块塔板两相间分配达平衡；多次分配平衡后K小的先出柱；K 有微小差异的组分可获较好分离。假想（一）塔板理论的四个基本假设在柱内一小段高度内组分分配瞬间达平衡（H理论塔板高度）；载气非连续而是间歇式（脉动式）进入色谱柱，每次进气一个塔板体积；样品和载气均加在第0号塔板上，且忽略样品沿柱方向的纵向扩散；分配系数在各塔板上是常数。（二）色谱峰的二项式分布 （N

15、 较少）逆流分布 萃取法利用物质在互不相溶两相中溶解度的不同。溶质含量分布服从二项式分布： 设载气中溶质含量为q，固定相中的溶质含量为p。如果 K0.5，则（三）色谱峰的正态分布（N50次）近似对称分布讨论： （四）理论板数和理论塔板高度的计算 理论塔板高度H ：为使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长。理论塔板数 n ：组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数。讨论注意： 计算n与组分有关，不同组分其n 值不同； n无量纲，tR与W 或 W1/2 单位必须一致。例： 在色谱柱长为 2m 的 5%的阿皮松柱、柱温为100 C，记录纸速度为2.0 cm/min的色谱条件下，测定苯的

16、保留时间为1.5 min，半峰宽为0.20 cm，求理论塔板数。解：讨论： neff 和Heff 扣除了死时间，更能真实地反映柱效 小 结1塔板理论的贡献：从热力学角度 解释了色谱流出曲线的形状和浓度极大点的位置； 阐明了保留值与K 的关系； 提出了评价柱效高低的n 和H 的计算式。2. 在比较相似柱的柱效时有用； 必须在给定条件，指定组分测定时才有意义。四、速率理论 成功之处：塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数。存在问题:做出了四个与实际不相符的假设，忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程；只定性给出塔

17、板高度的概念，却无法解释板高的影响因素；排除了一个重要参数流动相的线速度u，因而无法解释柱效与流速关系更无法提出降低板高的途径。（一）塔板理论优缺点塔板理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释： 峰形为什么会扩张？ 影响柱效的动力学因素是什么？可以发现：（二）Van Deemteer 方程式吸收了塔板理论的有效成果H，n从动力学角度较好地解释了影响柱效的因素涡流扩散项纵向扩散项传质阻抗项1. 涡流扩散项A（多径扩散项）：产生原因：载气携样品进柱，遇到来自固定相颗粒 的阻力路径不同涡流扩散 next影响因素：固体颗粒越小，填充越实，A项越小 讨

18、论： 注：颗粒太小，柱压过高且不易填充均匀 填充柱60100目 空心毛细管柱（0.10.5mm），A=0，n 较高nextnextback填料粒径与理论塔板高度的关系 色谱柱填料的粒径越小理论塔板高 度可降低（峰 变得尖锐）；在高线速度区 域，柱效的降 低得以缓和。线速度理论塔板高度曲线分析条件流动相 ：水/乙腈 （30/70，v/v）温度：40 检测：245 nm样品：烷基苯酮back2. 纵向扩散项 B/u （分子扩散项）：产生原因： 峰在固定相中被流动相推动向前、展开 两边浓度差 要为降低纵向扩散，宜选用分子量较大的载气、 控制较高线速度和较低的柱温选择载气原则：兼顾分析时间和减小纵向扩散 u 较小时，选M较大的N2气（粘度大）； u 较大时，选M较小的H2气、He气（粘度小）。影响因素： 讨论： 3. 传质阻抗项：C u产生原因：样品在气液两相分配，样品未及时溶解 就被带走，从而造成峰扩张。影响因素：