细胞膜微粒CD、CD与酒精性股骨头缺血性坏死的关系：随机对照实验方案

1、细胞膜微粒CD31、CD54与酒精性股骨头缺血性坏死的关系：随机对照实验方案 中国组织工程研究 第20卷 第44期 20161028出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 28, 2016 Vol.20, No.44 www. CRTER.org 研究原著 细胞膜微粒CD31、CD54与酒精性股骨头缺血性坏死的关系： 随机对照实验方案 杨 云，范海燕，黄 健，马忠平，张志峰(内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010030；内蒙古医科大学附属医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010030) 引用本文：杨云，

2、范海燕 ，黄健，马忠平，张志峰. 细胞膜微粒CD31、CD54与酒精性股骨头缺血性坏死的关系：随机对照 1 2 1 1 11 2 实验方案J.中国组织工程研究，2016，20(44):6667-6672. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.44.019 ORCID: 0000-0002-5382-4252(杨云) 文章快速阅读： 文题释义： 细胞膜微粒：是血管内皮损伤后从细胞表面脱落的一种小的膜性囊泡状物质，由磷脂和蛋白构成，直径在0.1-1 m，主要由血小板和内皮细胞释放。 细胞膜微粒CD31、CD54的功能：细胞膜微粒起源不同，作用不同。CD54由内皮源

3、性微粒特异表达，CD31由血小板及内皮细胞源性微粒共同表达；CD31、CD54可损伤血管内皮细胞，启动内源性凝血，影响血管舒张功能；CD31表面富含血小板因子、组织因子和黏附因子，可黏附于暴露的内皮下胶原；同时CD31还含有凝血因子，可为凝血酶原的激活提供更大的催化面积。因此细胞膜微粒CD31、CD54可通过介导血管炎症反应、促凝、影响血管舒缩及促进血管内皮损伤导致股骨头内微血管损伤。 摘要 背景：细胞膜微粒CD31、CD54可通过介导血管炎症反应、促凝、影响血管舒缩及促进血管内皮损伤导致股骨头内微血管损伤。文献已证实细胞膜微粒在激素性股骨头坏死中发挥重要作用，但是目前尚未见微粒与酒精性股骨头

4、缺血性坏死相关性的研究。 方法/设计：随机对照动物实验。健康雄性Wistar大鼠随机分为2组，模型组连续6个月灌胃给予烈性白酒制备酒精性股骨头缺血性坏死模型，空白对照组给予等量生理盐水灌胃。干预1-6个月，每月2组各随机取6只大鼠，分批取血，流式细胞仪检测血清细胞膜微粒CD31、CD54水平；取双侧股骨头，固定、脱钙、石蜡包埋切片，行苏木精-伊红染色光镜下进行空骨陷窝计数确定股骨头坏死情况，再行Verhoeff 氏染色及MSB微血栓染色观察股骨头内微血管损伤及微血栓形成情况；并分析细胞膜微粒CD31、CD54水平与股骨头坏死、血管内皮损伤及微血栓形成的相关性。 讨论：实验结果拟探讨细胞膜微粒C

5、D31、CD54在酒精性股骨头坏死中的作用，更加深入探讨酒精性股骨头坏死发病机制，对其早期诊断、早期治疗提供新的理论依据，可能为其治疗提供一种新的靶点。 伦理批准：实验方案经内蒙古医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号为YKD2016154。大鼠的实验操作和取材遵循关于善待实验动物的指导性意见的规定，并与美国国立卫生与健康研究院的指南一致。 关键词： 组织构建；骨组织工程；细胞膜微粒；酒精性股骨头坏死 主题词： 股骨头坏死；膜蛋白质类；组织工程 基金资助： 内蒙古自治区卫生和计划生育委员会医疗卫生科研项目(201301061)；内蒙古医科大学青年创新基金项目(YKD2015QNCX028) I

6、SSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 杨云，男，1980年生，内蒙古自治区包头市人，汉族，2013年内蒙古医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事骨与关节疾病诊断及治疗研究。 并列第一作者：范海燕，女，1980年生，内蒙古自治区呼和浩特市人，汉族，2015年内蒙古医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事骨与关节疾病影像学诊断研究。 通讯作者：黄健，博士，主任医师，内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010030 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2016)44-06667-06 稿件接受：2016-08

7、-16 6667 Yang Yun, Master, Attending physician, Second Affiliated Hospital, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China Fan Hai-yan, Master, Attending physician, Affiliated Hospital, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autono

8、mous Region, China Yang Yun and Fan Hai-yan contributed equally to this paper. Corresponding author: Huang Jian, M.D., Chief physician, Second Affiliated Hospital, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China www. CRTER.org Relationship of cell membrane m

9、icroparticles CD31 and CD54 with alcohol-induced avascular necrosis of the femoral head: study protocol for a randomized controlled trial Yang Yun1, Fan Hai-yan2, Huang Jian1, Ma Zhong-ping1, Zhang Zhi-feng1 (1Second Affiliated Hospital, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongol

10、ia Autonomous Region, China; 2Affiliated Hospital, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China) Abstract BACKGROUND: Cell membrane microparticles CD31 and CD54 lead to microvascular injury in the femoral head by mediating vascular inflammatory response,

11、promoting blood clotting, affecting vasomotion and promoting vascular endothelial injury. Studies have verified that membrane particles play an important role in steroid-induced necrosis of the femoral head, but there is no studies concerning relationship between microparticles and alcohol-induced a

12、vascular necrosis of femoral head. METHODS/DESIGN: This is a randomized controlled animal study. Healthy male Wistar rats will be randomly assigned to two groups. In the model group, rats will be intragastrically administered hard liquor for 6 consecutive months to prepare models of alcohol-induced

13、avascular necrosis of the femoral head. Blank controls will be intragastrically given an equal volume of physiological saline. In 1-6 months of intervention, six rats will be randomly selected from each group every month. Blood will be collected separately. Flow cytometry will be used to detect seru

14、m cell membrane particles CD31, CD54 levels. Bilateral femoral head will be fixed, decalcified, embedded in wax, and then sections. After hematoxylin-eosin staining, empty bone lacuna will be quantified under a light microscope to identify femoral head necrosis. Verhoffs staining and MSB microthromb

15、osis staining will be used to observe microvascular injury and microvascular thrombosis in the femoral head, and to analyze the correlation of CD31 and CD54 levels with femoral head necrosis, vascular endothelial injury and microvascular thrombosis. DISCUSSION: This study will investigate the effect

16、s of CD31 and CD54 on alcohol-induced avascular necrosis of the femoral head, explore the pathogenesis of alcohol-induced avascular necrosis of the femoral head, provide a new theoretical basis for early diagnosis and early treatment, and may provide a new target for its treatment. ETHICS APPROVAL:

17、The protocol has been approved by the Animal Experimental Ethics Committee of Inner Mongolia Medical University (approval number YKD2016154). Experimental procedures and materials of rats will be in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, which is consistent with the gu

18、ide of National Institutes of Health. Subject headings: Femur Head Necrosis; Membrane Proteins; Tissue Engineering Funding: the Medical and Health Research Project of the Inner Mongolia Autonomous Region Health and Family Planning Commission, No. 201301061; the Youth Innovation Fund Project of Inner

19、 Mongolia Medical University, No. YKD2015QNCX028 Cite this article: Yang Y, Fan HY, Huang J, Ma ZP, Zhang ZF. Relationship of cell membrane microparticles CD31 and CD54 with alcohol-induced avascular necrosis of the femoral head: study protocol for a randomized controlled trial. Zhongguo Zuzhi Gongc

20、heng Yanjiu. 2016;20(44):6667-6672. 1-3 1 实验设计 Experimental design 1.1 实验设计类型及描述 随机分组，动物体内实验。 1.2 实验完成地点 中国，呼和浩特市，内蒙古医科大学第二附属医院关节外科及内蒙古医学院分子生物学研究中心。 年上升。内蒙古地处北方高寒地区，特殊的文化背景 及饮食习惯，饮酒人群非常庞大，部分牧区人群每日饮酒，甚至以酒代饭，因饮酒所致股骨头坏死病例在日常诊疗中非常多见。故此，酒精作为诱因导致的股骨头坏死的发病已不容忽视。 多年来人们一直致力于研究酒精性股骨头缺血性坏死的发病机制，从酒精的细胞毒性、股骨头坏死的

21、全身或局部变化，组织学、细胞学、病理学、免疫学、分子生物学、生物化学、遗传学、血液学等各个方面的研究提出了多种学说，包括脂肪代谢紊乱学说、酒精的细 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org 2 学术背景及理论基础 Academic background and theoretical basis 2.1 前言 长期大量饮酒与股骨头缺血性坏死的发生之间的关系早已明确，且因饮酒导致股骨头坏死发病逐 6668 www. CRTER.org 胞毒性学说、骨质疏松学说、骨髓基质细胞成脂分化学说、骨内高压学说、基因多态性学说、血管内凝血学说等等，目前具体发

22、病机制不详 6-10 。尽管关于酒精性股 骨头缺血性坏死存在多种假说，但是到目前为止没有一种学说能完全解释酒精性股骨头缺血性坏死发生发展的全部病理过程，多数专家认同酒精性股骨头坏死为多种因素共同作用的结果。 2.2 背景研究 血管内凝血学说目前已经公认为所有非创伤性股骨头坏死的共同通路。股骨头内微循环障碍是股骨头缺血性坏死的病理基础已得到多数专家的认可，在大量股骨头坏死标本中检测到微血栓也证实了这一点，而血管内皮损伤是血管内血栓形成的中心环节11-16 。 目前研究证实，血管内皮损伤后可释放一种膜性囊 泡状物质，将其定义为细胞膜微粒 13 。细胞膜微粒由磷 脂和蛋白构成，直径在0.1-1 m，

23、主要由血小板和内皮细胞释放。细胞膜微粒起源不同，作用不同：CD54由内皮源性微粒特异表达，CD31由血小板及内皮细胞源性微粒共同表达；CD31、CD54可损伤血管内皮细胞，启动内源性凝血，影响血管的舒张功能； CD31表面富含血小板因子、组织因子和黏附因子，可以黏附于暴露的内皮下胶原；同时CD31还含有凝血因子，可为凝血酶原的激活提供更大的催化面积。因此细胞膜微粒CD31、CD54可通过介导血管炎症反应、促凝、影响血管舒缩及促进血管内皮损伤导致股骨头内微血管损伤 17-20 。那么细胞膜微粒是否同样参与股骨头内血栓形 成呢？细胞膜微粒是否可以作为一种早期筛查股骨头坏死的敏感指标呢？是否有一种药

24、物通过抑制微粒的产生预防股骨头坏死呢？ 文献已证实细胞膜微粒CD31、CD54在激素性股骨头坏死中发挥重要作用。如郑敏哲等 21 的体外细胞学实验发现，激素可刺激内皮细胞产生细胞膜微粒，进而破坏内皮细胞之间的连接,导致内皮细胞通透性增高，降低血管稳定性，进一步引起股骨头缺血坏死。吴志宏等 13 报道大剂量糖皮质激素可使兔体内血小板和内皮细胞源性膜微粒数量显著增加，干预药物能够抑制微粒的产生，或许有助于预防或避免激素诱发股骨头缺血坏死的发生。康鹏德等 22 则指出，应用大剂量糖皮质激素后兔体内血小板和内皮细胞源性膜微粒(CD31、CD54、CD62E)数量增加，这可能是激素诱发血液高凝易栓、导致

25、股骨头缺血坏死发生的原因之一，抑制微粒的产生或许有助于预防或避免激素诱发股骨头缺血坏死的发生。但是，目前尚未见微粒与酒精性股骨头缺血性坏死 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 相关性的研究。 2.3 前期实验介绍 从2000年开始，课题组一直致力于研究非创伤性股骨头坏死的发病机制研究。2001年进一步证实内蒙古自治区科委自然科学基金资助课题“前凝血状态下应用激素导致骨坏死的实验研究”，并在动物股骨头内发现大量血栓形成，随后陆续发表多篇文献证实。近年，课题组对酒精性股骨头坏死的研究也取得进展，证实一些血管炎性递质参与酒精性股骨头血管损伤，从而导致股

26、骨头坏死 23 。 前期实验已经通过长期灌胃烈性白酒模拟人类饮酒，成功建立了酒精性股骨头缺血坏死大鼠模型，证实长期摄入乙醇可导致大鼠股骨头内微血管内皮损伤，局部微循环供血异常，诱发股骨头缺血性坏死，且坏死程度与乙醇累积摄入量相关。 2.4 研究的理论依据 近年国内外学者对酒精性股骨头缺血性坏死机制研究热点为血管内凝血学说，微粒作为检测血管损伤及血栓形成的一种新的标记物正成为共识 24-26 。微粒通过损伤的血管内皮细胞释放后，通过 介导血管炎症反应、抑制血管的收缩、启动凝血等多种途径导致血栓形成 27-28 。已有学者证实其在激素性股骨 头坏死中发挥重要作用。课题首次提出微粒是否与酒精性股骨头

27、坏死相关，并通过制作酒精性股骨头坏死大鼠模型，检测饮酒前后大鼠血清中细胞膜微粒CD31、CD54的变化，结合病理学染色观察股骨头内血管损伤及血栓形成情况，探讨细胞膜微粒在酒精性股骨头坏死中的作用。更加深入探讨酒精性股骨头坏死发病机制，对其早期诊断、早期治疗提供新的理论依据，可能为其治疗提供一种新的靶点。 3 研究目的 Study purpose 3.1 主要目的 研究细胞膜微粒CD31、CD54是否与血管内皮损伤及血栓形成相关；探讨细胞膜微粒CD31、CD54在酒精性股骨头坏死中的作用。 3.2 次要目的 证实长期大量饮酒可导致大鼠股骨头缺血性坏死。 4 动物的选择 Animal select

28、ion 选择成年健康雄性Wistar大鼠，鼠龄四五个月，体质量(24030) g，由内蒙古大学动物实验研究中心提供，许可证号：SCXK(蒙)2002-0001。所有Wistar大鼠体型正常，健康状况良好，排除健康状况不良，不活泼，有发烧、腹泻等症状者。 6669 CRTER.org 5 实验方法 Experimental methods 5.1 酒精性股骨头缺血性坏死大鼠模型建立 Wistar大鼠灌胃给予46度烈性白酒10 mL/kg，1次/d，连续6个月。 5.2 分组处理及取材 雄性Wistar大鼠随机分为2组，模型组连续6个月灌胃给予烈性白酒制备酒精性股骨头缺血性坏死模型，空白对照组给予

29、等量生理盐水(10 mL/kg， 1次/d，连续6个月)。每个月2组各随机取6只大鼠，分批取血后处死，取下双侧股骨头进行各项检测。 5.3 指标检测 5.3.1 血清中细胞膜微粒CD31、CD54检测 每月两组各取血4 mL入抗凝管，取血后2 h内分次离心，获得富含微粒血浆，加入抗体，常温孵育20 min，流式细胞仪检测CD31、CD54含量。 5.3.2 股骨头空骨陷窝率 将所取双侧股骨头，用40 g/L多聚甲醛(pH=7.2)固定24 h，10%乙二胺四乙酸(EDTA，pH 7.4)脱钙8周，沿股骨头冠状面切片，石蜡包埋切片，厚度5 m。然后作苏木精-伊红染色，光镜下观察组织形态学变化，计

30、数空骨陷窝率，确定股骨头坏死情况。 5.3.3 微血管损伤情况 股骨头固定、脱钙、石蜡包埋切片后，按相应步骤进行Verhoeff 氏染色，随机抽取每张切片5个视野，观察动、静脉的各层结构及血管内皮细胞的形态，比较血管损伤阳性率。 5.3.4 微血栓检测 股骨头固定、脱钙、石蜡包埋切片后，按相应步骤进行MSB微血栓染色。每组在显微镜下连续观察50个视野，计数微血栓数量。 6 研究设计 Study protocol 6.1 研究设计概要 随机分组干预，动物体内实验。 6.2 实验计划 实验计划解决3个问题：证实长期大量饮酒可导致大鼠体内细胞膜微粒CD31、CD54含量增加，并与酒精摄入量呈正相关；

31、证实酒精性股骨头坏死主要原因为血管内皮损伤及微血栓形成，进一步揭示酒精性股骨头坏死发病机制；证实细胞膜微粒CD31、CD54参与酒精性股骨头坏死发病，从而为酒精性股骨头坏死的治疗提供新的靶点。 6.3 实验步骤 (1)建立酒精性股骨头缺血性坏死大鼠模型。 (2)流式细胞仪检测血清细胞膜微粒CD31、CD54含量。 (3)光镜下组织形态学观察，计数股骨头空骨陷窝，确定股骨头坏死情况。 (4)进行Verhoeff 氏染色，观察股骨头血管内皮损 6670 伤情况。 (5)进行MSB微血栓染色，观察微血栓。 6.4 实验动物脱落情况 在实验过程中有大鼠死亡脱落者，记录并分析原因，不再补足动物数量。 6

32、.5 技术路线图 见图1。 7 指标与观察 Outcome measurement 7.1 主要观察指标 血清细胞膜微粒CD31、CD54水平；股骨头空骨陷窝率；股骨头动静脉血管损伤阳性率；股骨头微血栓数。 7.2 次要观察指标 细胞膜微粒CD31、CD54水平与股骨头坏死、血管内皮损伤及微血栓的相关性。 7.3 实验观察指标一览表 见表1。 8 统计方法 Statistical analysis 8.1 研究假设 所有假设检验均为双侧检验，P 0.05认为差异有显著性意义。 8.2 样本量 根据预实验结果每组大鼠数量定为40只。 8.3 实验分析 应用SPSS 13.0统计学软件完成数据统计

33、分析，计量资料(包括细胞膜微粒CD31、CD54水平；股骨头空骨陷窝率；股骨头动静脉血管损伤阳性率及股骨头微血栓数)用x_ s表示，采用方差分析。细胞膜微粒CD31、CD54水平与股骨头坏死、血管内皮损伤及微血栓的相关性分析采用线性相关分析。 8.4 统计分析 由不参与实验的专业统计人员完成统计工作。在所有数据录入、审核完毕后，统计人员应及时完成统计分析工作，交付实验的主要研究者，写出研究报告。 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org www. CRTER.org 表1 数据观察记录表 (xs) Table 1 Data records _

34、指标 模型组 1个月 37.396.75 42.2611.27 11.072.45 5.201.13 0.730.53 空白对照组 1个月 27.9211.26 35.146.23 10.531.66 5.201.00 0.560.30 2个月 34.235.02 40.692.32 12.803.13 5.931.46 0.970.96 2个月 25.209.58 35.146.23 12.02.78 5.761.19 1.240.80 3个月 39.6212.99 48.364.83 14.003.02 8.471.87 2.171.23 3个月 20.776.49 32.284.21 1

35、2.472.56 6.171.46 1.230.90 4个月 45.983.33 48.617.36 20.933.18 13.4333.48 8.173.27 4个月 26.7410.04 31.473.31 13.472.34 5.871.70 1.230.90 5个月 57.116.73 60.945.65 30.404.65 15.772.93 15.503.40 5个月 26.8410.71 35.146.63 14.002.68 6.501.70 0.970.93 6个月 56.655.24 59.384.92 29.934.86 20.075.25 18.633.12 6个月 2

36、6.4210.72 35.146.63 14.272.15 6.501.36 1.000.91 CD31 CD54 空骨陷窝率 血管损伤阳性率 微血栓数 指标 CD31 CD54 空骨陷窝率 血管损伤阳性率 微血栓数 9 行政部分 Administration 9.1 实验用试剂及仪器 46度白酒购自北京红星股份有限公司，由专人保存，每天实际用量均有相应的记录。相关实验试剂已与厂家及代理商取得联系；内蒙古医学院分子病理学实验室提供实验仪器。 9.2 动物的饲养 内蒙古大学提供质量合格的实验动物，专人饲养，标准饮食，分笼喂养，自由饮水，实行12 h/12 h间断照明，饲养环境温度控制在(242)

37、 。 9.3 数据质量保证 结果数据表格由研究者制作，研究者认真填写数据记录表，记录过程不遗漏项目，经常核对；监察员应定期确认所有的数据记录正确完整，与原始记录一致；由2个数据录入员负责抄录实验结果，分别将抄录后的文档标注日期上传至指定的电脑备份。 子版数据两种形式，电子版数据由研究者核对并对数据库进行锁定，锁定后的数据文件不允许再作变动并将数据库保存备查，任何非授权内研究者外的人员均不得接触。书面数据存放于固定地点并加锁，钥匙由资料管理员和研究室负责人保管。 10.5 资料存档 所有原始资料由文档管理员专人完整保存，同时复制一份电子版资料，以方便使用。 10.6 文章发表 实验完成后总结实验

38、数据，进行实验数据的统计学分析，撰写研究报告，总结报告，作结题的准备。由主要研究者撰写科研论文。 11 参考文献 References 1 Jones JP Jr. Intravascular coagulation and osteonecrosis. Clin Orthop Relat Res.1992(277):41-53. 2 李子荣.科学诊断和治疗股骨头坏死J.中国修复重建外 科杂志,2005,19(9):685-686. 3 Drescher W, Pufe T, Smeets R, et al. Avascular necrosis of the hip-diagnosis an

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40、710-711. 6 Van der Zee PM, Biro E, Ko Y, et al. P-Selectin -and CD63- exposing platelet microparticles reflect platelet activation in peripheral arterial disease and myocardial infarction. Clin Chem.2006;52(4): 657-664. 10 总条款和协议 Terms and conditions 10.1 科研审查委员会 由内蒙古自治区卫生厅及内蒙古医科大学批复，同意开展“细胞膜微粒CD31、

41、CD54与酒精性股骨头缺血性坏死相关性研究”相关研究。 10.2 伦理指导 由内蒙古医科大学动物实验伦理委员会进行审核。 10.3 伦理批准 实验方案经内蒙古医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号为YKD2016154。大鼠的实验操作和取材遵循关于善待实验动物的指导性意见的规定，并与美国国立卫生与健康研究院的指南一致。 10.4 研究数据的保密 实验数据包括书面数据和电 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 6671 CRTER.org 7 Wills TB, Wardrop KJ, Meyers KMDetection of activated

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