基因突变与DNA损伤修复课件

1、基因突变与DNA损伤修复主讲：杨在君本章主要内容点突变及其分子效应点突变的诱变剂自发突变动态突变DNA损伤修复机制基因突变的检测一、点突变及其分子效应2、点突变的类型1、概念：point mutation: 指单个碱基的改变，简言之突变发 生在基因的一个“点”上。类型碱基替换碱基增加及缺失转换：Py Py; Pu Pu，多见颠换：Py Pu ; Pu Py ，少见插入1个碱基对删除1个碱基对3、点突变的分子效应 同义突变（synonymous mutation):碱基序列的改变没有引起产物氨基酸序列的改变,与密码子的简并性有关。TACTTATUACUAUTyrTyrDNARNAAA（1）突变发

2、生在基因编码区内 错义突变（missense mutation): 碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变。TACTTCCUACUCCTyrSerDNARNAAA 有些错义突变严重影响蛋白质活性甚至完全无活性，从而影响了表现型。如果该基因是必须基因，则称为致死突变。 有些错义突变的产物仍有部分活性，使表型介于野生型与突变型之间的中间类型，称为渗漏突变。 有些错义突变不影响或基本上不影响蛋白质的活性，不表现明显的性状变化，称为中性突变。 无义突变（nosense mutation): 某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变成了终止密码子，使蛋白质合成提前终止，因而蛋白质产物一般是没有活性的。

3、TACTTAAUACUAATyr终止DNARNAAA 移码突变（frameshift mutation): 由于插入或缺失单个或几个（非3个）碱基，从而改变了自突变位点到开放阅读框的终止密码子间的全部序列。（2）突变发生在基因非编码区内4、可逆转的突变效应 当某个基因A突变成a以后，也可以再向反方向发生突变，回复成原来的A，并使表型恢复原状，这叫回复突变（reverse mutations/ reversion/back mutation）正向突变（Forward mutation）：是引起基因型从野生型变为突变型的突变。Aa回复突变正向突变（1）真正回复（true reversion)对原来

4、突变的严格逆转AAA (Lys)GAA (Glu)AAA (Lys)wild-typemutantwild-typeReverseForwardTrue reversion（2）抑制（基因）突变（suppressor mutation) 一种突变的效应可由另一种抑制基因突变（suppressor mutation）来减少或取消，即：在不同于原来的位点的突变（也叫第二或第二点突变Second-site mutation）a/xReversea/xb/ysuppressor5、功能丧失突变和获得功能的突变（1）功能丧失突变（loss of function mutation) 蛋白质的活性减弱或消

5、除，通常为隐性突变。（2）获得功能的突变（gain of function mutation) 这种突变赋予了蛋白质异常的活性，并可能产生新的表型。13.2 点突变的诱变机制诱发突变（induced mutation）：由各种诱变剂诱发产生的突变。诱变剂（mutagen）：凡是可以诱发基因突变的因素（物理，化学）称为诱变剂，某些诱变剂往往同时具有致癌作用，因而又称为致癌剂（carcinogen）。诱变剂的作用机制：（1）取代DNA中的一个碱基；（2）改变一个碱基使之在DNA复制中发生错配；（3）破坏一个碱基使其在正常情况下不能和任何碱 基配对。1、碱基类似物： 其分子结构极其相似于DNA分子中

6、的正常碱基，故可以结合进复制的DNA链中去。（1）5-溴尿嘧啶（5-BU）： 引起突变的原因是：它们能够以互变异构体的状态形式存在。一种普通状态（酮式）和一种稀有状态（烯醇式）两种状态中的每一种状态与DNA的一种不同的碱基配对，结果产生碱基对替换突变（substitution mutation）。5-BU诱变机制（2）2-氨基嘌呤（2-AP）： 引起突变的原因是：它既可以作为腺嘌呤的类似物与胸腺嘧啶配对，当发生质子化后又可以与胞嘧啶发生错配。 2AP诱导碱基转换突变，可以从AT GC或GCAT，取决于它最初整合进入DNA时的状态。2、碱基改变： 某些诱变剂并不掺入DNA而是通过碱基改变（bas

7、e alteration) 从而造成特异性的碱基错配。（1）烷化剂 烷化剂是带有一个或几个不稳定烷基的化合物，能同碱基起作用，使之带上烷基（CH3，CH2CH3），继而引起复制时碱基错配。烷化剂种类很多，比较常用的有：乙基甲磺酸（Ethyl methane sulfonate， EMS）亚硝基胍（Nitrosoguanidine, NG）（2）嵌入剂嵌入剂原黄素（proflavin） 吖啶橙（acridine） 溴化乙淀（Ethidiumbromide）嵌入剂是一些扁平的分子，可以嵌入DNA的碱基对之间，造成碱基对发生倾斜。并在嵌入位置导致单核苷酸对的插入/缺失，引起移码突变。3、碱基损伤 某

8、些诱变剂可以造成单个或多个碱基损伤（base damage）因而DNA复制时不能进行特定的、正常的配对。DNA聚合酶不能越过那些损伤的碱基而导致复制过程被阻断。（1）紫外线（UV） 紫外线引起突变，因为DNA中嘌呤和嘧啶碱基在紫外分布区（254260nm）有一个非常强的紫外光吸收，在该波长UV能诱导相邻嘧啶形成嘧啶二聚体，直接影响DNA的复制与转录。（2）黄曲霉素B1（aflatoxin B1, AFB1）AFB1 AFB1在鸟嘌呤N7位置上形成加成复合物，导致碱基和糖之间的糖苷键断裂，因此释放出碱基形成无嘌呤位点。4、基因的定点突变 基因的定点突变（site specific mutagen

9、esis of gene) 是指按照人们的意愿对基因的编码区和表达调控区（包括启动子区）进行缺失、插入或碱基替换等过程。（1）寡核苷酸诱导的基因定点突变 将某基因克隆到载体上人工合成含有突变位点的一对引物（突变位点位于引物中心附近，两端有足够的序列足以互补配对）PCR扩增Dpn酶切将突变DNA转入受体筛选重组子。（2）双引物法13.3 自发突变概念：自发突变（spontaneous mutation) : 在无人干预的条件下，自然发生的基因突变。突变率（mutation rate)：在一个世代中或其他规定的单位时间内，在特定条件下，一个细胞发生某一突变事件的概率。1、自发突变的特征突变的稀有性

10、。高等生物的自发突变率一般为110-5110-10；细菌的自发突变率一般为 110-4110-10突变的可逆性 。染色体缺失或重复的突变不可逆his+his-210-6410-8his+his-正向回复突变的多方向性和复等位性。一个基因可以向不同的方向突变，形成一个以上的等位基因。 A a1, a2, a3 . anAa2aa1突变可以发生在生物个体生长发育的任何一个时期，但生殖细胞中的突变率最高。2、自发突变的机制（1）自发损伤脱嘌呤脱氨基 过氧化物原子团（O2-）、（H2O2）、（OH-）等有氧代谢的副产物，都是有活性的氧化剂， 它们可导致DNA的氧化损伤，T氧化后产生T乙二醇，G氧化后产

11、生8-氧-7-氢脱氧鸟嘌呤， 8-氧-7-氢脱氧鸟嘌呤可和A错配，导致GT。（2）碱基的氧化损伤（3）DNA复制错误（4）其他可能的机制放射性同位素射线、宇宙射线、紫外线等理化因素。剧烈变化的温度和极端温度。特殊结构的基因，不能被损伤修复系统识别。自发突变也与重复序列有关。13.4 动态突变（自学）13.5 DNA损伤修复机制 如果所有DNA损伤都不修复，细胞将很快死亡，这是因为致死突变的积累和依赖于DNA完整性的一些关键过程被抑制(这些过程包括复制和转录)。细胞发展了众多的机制来处理DNA损伤，这可被分为以下几类：光复合修复（photoreaction repair or light rep

12、air）切除修复（excision repair）错配修复（DNA mismatch repair）重组修复（recombinational）SOS修复（SOS repair)（1） 光复合修复Photoreactivation repair: uses a white-light-dependent enzyme to split cyclobutane pyrimidine dimers formed by ultraviolet light.在可见光的激活下，光修复酶结合于胸腺嘧啶二聚体处，并催化解聚为单体的过程。不同的生物体利用不同的类似酶。（2） 切除修复 切除修复是在DNA内切酶、

13、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA连接酶等共同作用下，将DNA分子受损伤的部分切除，并以完整的一条链为模板，合成切除的部分使DNA恢复正常结构的过程。 切除修复过程中，损伤的DNA链由切除酶（excinuclease）切除，此酶也是一种核酸内切酶。编码内切酶是由多个亚基组成的Uvr基因。 切除修复切口切口UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶OHPDNA连接酶NAD+大肠杆菌中的UvrA可识别DNA损伤部位，引导UvrB和UvrC与其结合形成复合体。由UvrC完成对DNA 单链的切割，被切除的碱基在解链酶的作用下从DNA上脱离，然后由DNA聚合酶以互补链合成DNA，DNA连接酶封闭其缺口，

14、从而完成DNA损伤修复。 患者不能接受太阳的紫外线，否则在皮肤暴露部位就会诱发皮肤癌，通过深入研究发现，该病患者皮肤细胞中的切除修复酶系统存在缺陷，不能对UV诱发的大量DNA损伤进行有效的修复，特别是人的抑癌基因p53发生突变就会促进癌症的发生。 着色性干皮症（xeroderma pigmentosum） AP 核酸酶修复途径 在DNA链上无嘌呤和无嘧啶位点叫做AP位点。AP核酸内切酶可以通过剪切AP位点上的磷酸二酯键使链断裂，进一步由外切酶、DNA polI 和连接酶进一步进行修复。（3） 错配修复系统 错配修复系统（DNA mismatch repair system，MMR）可能在DNA

15、复制过程中对于错配碱基的修复和由此产生的基因转换发挥一定的作用，现在已知许多生物包括人类中均存在具有一定方向性的错配修复体系。通常错配系统倾向于修复新生链上的碱基。因此对正确母链和错配子链的区分至关重要：亲本链上带有甲基，刚合成的子链尚未甲基化 E. coli错配修复系统包括9个蛋白成分，其中最重要的有MutS、MutL、与MutH，MutS识别错误配对的碱基并与其结合（MutS二聚体）、MutL和MutH蛋白按顺序加入，并与Muts协同作用。MutH在含有错配碱基的单链上切口，在螺旋酶II作用下解开双螺旋。随后在一种双向性外切酶的作用下依次从切口处切除，直到切除错误的核苷酸。再由DNA po

16、lIII 填充空隙，进行修复合成，最后由连接酶连接。由于切口和错配核苷酸相距很远（12kb）,故这种修复是一种长片段修复。（4） 复制后修复-重组修复系统a 复制：以损伤单链为模板复制时，越过损伤部 位，对应位点留下缺口；未损伤单链复制成完整双链。b 重组：缺口单链与完整同源单链重组，缺口转移到完整链，使损伤单链的互补链完整，损伤单链仍然保留。c 再合成：转移后的缺口以新的互补链为模板聚合补齐。（5） SOS 修复 SOS 修复（SOS repair） 这也称差错倾向修复（error prone repair），是细胞中的DNA 受到大规模损伤，严重影响其生存，在其他修复难以见效的情况下，被诱

17、发出来的一种高效修复系统，这种修复是为了保命也就管不了修补的片段是否正确,这也是生物为了维持其生命的延续，不得已采取的一种以牺牲遗传物质的忠实性，冒着产生大量基因突变风险的“保命”措施。表现特点: 细胞内原有的修复酶（切除修复、 重组修复）合成量增加；诱导产生的修复酶（SOS聚合酶）来修复损伤部位。 SOS 反应 机体受到大剂量的诱变产生大规模DNA损伤时，可产生一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS response），包括生长抑制、分裂停止、呼吸受阻、整合在宿主基因组上的原噬菌体释放、细胞正常生长发育的许多基因关闭，同时有一些应激状态下的新基因开放等，这些基因使机体DNA损伤得以高效修

18、复，细菌又可逐渐回复到正常状态。 SOS修复机制a 通过式修复：正常的DNA多聚酶复制到损伤位点时，其活性受到抑制，短暂抑制后产生一种新的DNA多聚酶，该酶可以通过损伤部位，由于其修复校正功能较低，新合成的DNA碱基错配频率较高，易引起突变。b 切除式修复：如果DNA双链上均有损伤，而且距离较近，机体可能先对其中一条链采取切除式修复，一个位点修复正常，另一个则产生错误，再对另一条链切除式修复，又会保留这个基因突变。也可能在复制后由外切酶的作用下扩大缺口，发生通过式修复产生错误，形成新的突变。13.6 基因突变的检测1、病毒和细菌基因突变的检测 利用寄主范围、生长速度、噬菌斑大小、形态等性状可检测病毒突变。抗性突变检测： 通过在培养基中添加抗生素或噬菌体即可筛选细菌抗性突变体。营养缺陷型突变检测：利用在完全培养基上能正常生长，在基本培养基上不能生长的影印培养实验。首先采用青霉素富集法浓缩大量突变体，再进行负选择。2、真菌营养缺陷型的检测分生孢子诱变处理基本培养基 未萌发孢子萌发菌丝培养去除(过滤)少数 死亡营养野生型 孢子缺陷型(去除) 营养培养基3、果蝇突变体