山东大学研究生国家课程-基因工程学原理-工具酶

1、第二部分 基因工程工具酶及其应用限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。一、核酸内切酶restriction endonuclease, RE是一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。存在于原核及真核细胞中，但在原核细胞中表达丰富，可以限制外来DNA的侵入并使之失去活性，但不影响自身DNA是原核生物限制-修饰（R-S)系统

2、的重要组成：R-S系统： 限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶(甲基化酶)出现。修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同,但只甲基化每条链中的一个碱基,而不是切开DNA链，使得DNA不被切割，因而其作用是保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏。 （ 一） 限制性内切酶的发现 1.细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。(噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象 ) 2. 限制酶HindII的发现 HOSmith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。 3. SV40

3、限制图谱和转录图谱的绘制 D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。 Werner Arber ， HOSmith和D. Nathans三人共同获得了1978年诺贝尔生理学或医学奖。 限制性内切酶的生产分离纯化-克隆表达 （NEB）到 2005 年 1 月，共发现 3681 种限制酶，其中 型、 型、 型限制酶各有 59 、3612 、10 种；商业化的限制酶有 588 种，其中 型限制酶中共有 221 种特异性。 第一个字母（大写） 代表产生该酶的微生物（宿主菌）属名 第二、三个字母（小写，斜体）代表种名 第四个字母（斜体）代表菌的株或型 罗马字母发现和分离的顺

4、序例如：Hind：来自流感嗜血杆菌H. influenzae “” 型血清型第三个限制酶。EcoRIEscherichia coli RI HindHaemophilus influensae d SacI (II)Streptomyces achromagenes I ()（二）限制性内切酶的命名 I 型限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶 III 型限制性核酸内切酶（三） RE的分类及特点复合功能酶，具有多种功能：R 亚基： hsdR基因编码 酶切 M 亚基： hsdM 基因编码 修饰作用S亚基： hsdS 基因编码 识别DNA序列在DNA链上的识别和切割位点不一致没有固定的切割位点

5、，在距识别位点1至几个kb处随机切割，不产生特异末端。I型限制酶III 型限制性酶属于复合功能酶 R 亚基： hsdR基因编码 酶切 M S亚基： hsdM 、hsdS基因编码 识别DNA序列、修饰作用特点：在距识别位点约25bp处切割DNA，切割位点难以预测。 II 型限制性酶 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上特点：在识别位点中或靠近识别位点切割。 酶分子内切酶与甲基化酶识别位点切割位点限制反应与甲基化反应限制作用是否需用 ATP 型酶 分子不在一起4-6bp, 大多数为回文对称结构在

6、识别位点中或靠近识别位点分开的反应No 型酶三亚基双功能酶二分非对称无特异性，至少在识别位点外 1000bp互斥Yes型酶二亚基双功能酶5-7bp 非对称在识别位点下游 24-26bp同时竞争Yes各类RE的比较（四） II 型限制性酶(p45)1、功能特点：识别和切割双链DNA的特定序列，产生特定的DNA末端。2、II型酶识别序列特点：识别序列一般在46个碱基对，通常为反向互补序列，即具180旋转对称性，又称回文结构（ Inverted Palindrome）II型酶识别序列特点 ）识别-8个相连的核苷酸当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256

7、 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。 BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGNNNNNCCGG ）富含 ）对称性双对称（回文结构， Inverted Palindrome） EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 ）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 ）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和- 3、 酶切末端类型平齐末端粘末端5 粘性末端3 粘性末端非对称突出末端相容性末端1)平齐末端（blunt o

8、r flush end）: 在识别序列的对称轴上切割双链DNA ,形成平齐末端。 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-52)粘末端（cohesive end or sticky end ) 在识别序列对称轴的相应位点切割靶基因，产生一条p5 单链延伸的粘性末端。 5 粘性末端 EcoR I-5-3G 5pAATTC-3 3-CTTAAp5 3G-5 + 3 粘性末端 在识别序列对称轴的3 末端切割，产生3- OH单链延伸的粘性末端。EcoR I5-CTGCAOH3 5 G-33-G5 3HOACGTC-5+PstI 3） 非对称突出

9、末端 ）当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的，称非对称突出末端，如： BbvC CCTCAGC CC TCAGC GGAGTCG GGAGT CG ）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG; CTCGGG; CCCGAG; CTCGAG + 4）相容性末端如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。 BamHI + MboI A/

10、C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C 不同末端的连接特性: 除第4种末端不能进行不同DNA分子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种末端可以相互连接。4、几类特殊的II 型限制性酶（p47） 异源同工酶（同裂酶） 同尾酶 远距离裂解酶 可变酶 异源同工酶（isoschizomers）（p47） 指来源不同但识别序列相同的酶。该类酶切割DNA的位点可相同/不同。如： 5GGTAC C 3 5GGTAC pC3 3C CATGG 5 3Cp

11、CATGG5 5G GTACC 3 5G pGTACC3 3CCATG G 5 3CCATGp G5 KpnI +Asp718I+ 同尾酶（isocaudarner enzyme）（47） 识别与切割顺序相互有关的酶。来源各异，识别序列也各不相同，但作用后产生相同的粘性末端。BamHIN N AN N T C T A GG A T C C N N N G N N NSau 3ABglIIN N GN N C C T A GN N NN N N C T A GG A T C N N N N N NG A T C T N N N A N N N 远距离裂解酶（distant cleavage en

12、zyme ) (47） 这类酶的识别与切割位点不一致，但其切割位点和识别位点的距离是一定的，一般为10个碱基左右。 MboII GAAGANNNNNNNN Hga I GACGCNNNNN 可变酶( variable enzyme)p48 II型酶中一个特例，他的识别序列中有一个或几个核苷酸是可变的，且识别序列一般大于6个碱基对。BstpI GGTNACC （其中1个碱基可变）Bgl I GCC（N）4 N GGC (识别序列中有5 个碱基可变）5、影响II型限制性酶作用的因素(p48)离子强度、pH的影响 如 MgCl2由5mM 2mM (pH8.5)使酶对底物识别专一性降低EcoRI GA

13、ATTCEcoRI* NAATTN 5mmol/L MgCl22mmol/L MgCl2 酶量的影响 ：过量会影响酶的识别顺序 一般应参考酶切单位. 酶的用量单位（u）： 将1 g 底物（ DNA）在50l终反应体系中，在推荐的反应缓冲液和温度下反应一个小时,达到安全酶解所用DNA的酶量为1u 。其他影响因素： 酶切反应温度、酶解时间、某些试剂等 均可改变酶的专一性 如 疏水试剂甘油，二甲基亚砜存在时，会使BamH I 的识别和切割特异性发生改变 6、限制酶的星反应（star activity） 酶切反应不当时会导致酶的星号活性或称星反应特点: 限制酶识别序列特异性降低表1 具有星反应的限制性

14、内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件a识别序列AvaI 1, 2, 4BamHI 1 - 5, 8 G GATCN, G PuATCCBstI 2, 4BsuI 2, 4, 6EcoRI 1, 2, 4 - 6 N AATTNHae 2, 4HhaI 2, 4, 7Hind 6HpaI 1, 2, 4PstI 1, 2, 4, 7Pvu 2, 4SalI 1, 2, 4, 7ScaI 4 - 6, 8 Sst 2, 4XbaI 2, 4, 7：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(25U/g)； 5：Mn+代替Mg+；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8

15、%); 8:无NaCl。 与RE共同组成 限制修饰系统可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同二、甲基化酶 定义：与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统:dam甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基: G mATCdcm甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲

16、基 : C mCA/TGG 对甲基化酶敏感的RE: 对甲基化的DNA敏感，不能切割相应的序列，如 Bcl、 Cla、 Xba 等。对甲基化不酶敏感的RE ：对甲基化的DNA不敏感，能够切割相应的序列，如 有 BamH、 Sau3A、 Bgl、 Pvu 等。 Mbo 和 Sau3A 识别和切割位点相同，但其差异就在于前者对甲基化敏感。Ecoli 的dam、dcm甲基化酶Sss 甲基化酶Sss 甲基化酶来自原核生物 Spiroplasma ，可使 CG 序列中的 C 在 C5 位置上甲基化： CmG 。甲基化的模板可以是甲基化或半甲基化链（新合成链）的 DNA 链。 许多酶对此甲基化敏感，如 Aa

17、t、 Cla、 Xho、 Sal 等，也有不敏感的，如 BamH、 EcoR、 Sph 和 Kpn 。表 1 甲基化酶与识别序列甲基化酶 识别序列a 受甲基化影响的限制酶b AGmCT Alu, BamH, Bsp1286 Dde,HgiA, Nhe, Pst GGATmCC BamH, Msp ATCGmAT Cla, Mbo, Taq dam GmATC c dcm CCA/TGG c GAmATTC EcoR d GCNGC GGmCC Mst, Pst, Pvu GGmCC Ban,Bgl,Bsp1286,BstX,Hae, Msp,Nae,Nco,Sac, Sau96 GmCGC A

18、ha, FnuD, Hha CmCGG Aha,Ava,Ava,Hpa,ScrF TmCACC Hinf, Hph, Sau3A mCCGG BamH, Msp CTGCmAG Alu, Pst TCGmA AluI, Ava, EcoRV, HinC, Hinf, Mbo, Taq, Xmna.标在碱基的左上角的m表示该碱基被甲基化; b.所列出的限制酶均已商品化; c.参见表分离自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，GCNGC的甲基化位点尚未确定。表2 对甲基化敏感的限制性内切酶限制酶& 识别序列* 甲基化酶Ava GG(A/T)CC(A/T)GG dcmBcl TGATCA dam

19、Cla GATCGAT dam EcoR CC(A/T)GG dcmHph GGTGATC damMbo GATC damNru GATCGCGA damSau96 GGNCC(A/T)GG dcmSauF CC(A/T)GG dcmStu AGGCCTGG dcmTag GATCGA damXba TCTAGATC dam *下横线字母表示限制酶识别序列, 蓝色字母表示dam甲基化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列; &绿色字母表示甲基化酶敏感的酶 ） 改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成 ） 甲基化分析表观遗传学重要研究内容甲基化酶的用途表观遗传学(epigenet

20、ic):在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰来调控基因表达，这种修饰以DNA甲基化最为常见，研究内容包括：染色质重塑、DNA甲基化、组蛋白修饰、X染色体失活，非编码RNA调控等。2003年人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium, HEC)宣布开始投资和实施人类表观基因组计划(HEP)。 特异性位点的DNA甲基化的检测 ：甲基化敏感性限制性内切酶（methylation-sensitive restriction Endonuclease，MS-RE）、甲基化特异性PCR（MSPCR）特点：能够把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3-

21、OH末端，催化核苷酸的聚合作用。335模板链53dNTPs53DNA聚合酶活性三、DNA聚合酶( DNA polymerase)常用DNA聚合酶大肠杆菌聚合酶I及其Klenow片段TaqDNA聚合酶逆转录酶1、大肠杆菌聚合酶I及其Klenow片段 大肠杆菌聚合酶I（p54） 5 3DNA聚合酶活性，使DNA链 沿53延伸 3 5外切酶活性，能从游离的3-OH端逐个降解 双链或单链DNA核苷酸成为单核苷酸 5 3外切酶活性，能从游离的5端降解双链 DNA成为单核苷酸 Klenow片段 从大肠杆菌DNA聚合酶I全酶中除去5 3外切酶活性片段NCKlenow fragment (68 kD)exon

22、ucleasepolymerasesmall fragment (35 kD)C5proofreadingexonucleasecatalytic大肠杆菌DNA聚合酶I全酶35353用途：探针标记2、 Taq DNA聚合酶分离自水生栖热菌，分子量为94,000，是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶(对95高温具良好稳定性)，最佳作用温度位7080，具有5 3外切酶活性，不具有 35外切酶活性可用于 聚合酶链式反应（PCR）及DNA测序 Taq Pol 和PCR 5 3 变性 3 5 5 3 引物 3 5 复性 5 3 5 3 3 5 引物 3 5 5 3 延伸 5 3 3 5 3 5 特性种

23、类机制用途高特异性Taq酶热启动Taq酶(QIAGEN的Hotstar）必需经过高温才能激活的酶高特异性扩增，一步法RT-PCR高保真Taq酶单一型的高保真酶（Pfu等）具有35外切酶活性降低错配率（2-510-510-6碱基/循环数）混合型的高保真酶高保真兼高特异性ProofStart DNA聚合酶具有35外切酶活性+具有热启动Taq高特异性、高保真扩增超长片段扩增Taq酶超长片段的扩增关于复杂模板的扩增扩增模板GC含量高（60%），有二级结构常见Taq酶种类多功能：依赖于RNA的DNA聚合酶，RDDP 以RNA为模板 53方向DNA聚合酶活性；以mRNA为模板催化合成互补的DNA（cDNA

24、）3 5 RNA外切酶(RNase H）活性，能特异降解RNA-DNA杂交分子中的RNA部分应用 构建cDNA文库； 反转录PCR（RT-PCR) 制备探针3 逆转录酶（Reverse transcriptase) (p52)1970年美国科学家和分别于动物致癌RNA病毒中发现的，他们并因此获得1975年度诺贝尔生理学或医学奖。主要有两类：AMV： 来自禽成纤维病毒逆转录酶具有内切酶活性，稳定性好引物延伸反应通常用AMV，AMV性能更好，对次级结构耐受。用AMV的延伸温度可达55 , 以消除次级结构，但在这样温度下，引物延伸反应的得率通常降低。 M-MLV：来自鼠白血病（莫洛尼鼠白血病病毒 ）

25、逆转录酶不具内切酶活性; RNase H活性低; 稳定性差最适温度为37，在更高温度下，M-MLV不稳定，但MMLV可合成更长的产物。 3 逆转录酶（Reverse transcriptase) (p52)逆转录过程DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的，最初是在大肠杆菌细胞中发现的四、DNA连接酶 (DNA ligase）p50是一种封闭DNA链上切口的酶：借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。 将两段DNA分子拼接起来的酶。 主要有T4 DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。 概念区分： 切口（nick）指DNA分子糖-磷酸主

26、链的破坏 缺口（gap） DNA分子核苷酸缺失，单独用DNA连接酶不能连接。返回G A A T C T A C T C C GC T T A G G A G G C5533ATOH35PNickG A A T C T A C T C C GC T T A G A G G C5533GapOH35Pds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口缺口(gap) 切口(nick) 断口(cut)3HO P53HO P5 T4DNA连接酶用途：DNA-DNA连接DNA-RNA连接RNA-RNA连接双链DNA粘性末端连接双链DNA平头末端连接用于基因克隆五、RNA聚合酶（RNA polymerase）依赖于D

27、NA的RNA聚合酶根据依赖的启动子不同，分为：SP6 RNA聚合酶T7 RNA聚合酶T3 RNA聚合酶用途： 主要用于RNA分子的体外合成： 1） 标记的RNA作为探针，常用于杂交，产生的RNA具高放射比活性 2） 蛋白质体外合成RNA聚合酶活性 六、末端修饰酶磷酸酶磷酸激酶末端转移酶 （一） 细菌碱性磷酸酶（BAP） 1.特点 1) 除去ss-DNA，ds-DNA 和RNA分子两端的3-和5-磷酸基 2) 对热稳定 2. 用途 1) 载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率 2) 核酸末端标记 （二） 牛小肠碱性磷酸酶（CIP） 与BAP相同，只是CIP对热敏感碱性磷酸酶（p57)

28、PPSPSPSSSPPPPSOHSPSPSSPPSPSHOSSS PPPSPSPSPSSTAGCTATATAATTAATTACG5353去除DNA末端5 磷酸基团 P -32PATP ATP 5 P OH 3 5 32P OH 33HO P 5 3 HO 32P 5 I II 5 P OH3 5HO OH3 5 P OH 3 3HO P 5 3HO OH5 3HO P 5 磷酸酶(I)与磷酸激酶(II)活性 磷酸激酶的交换反应（三）. T4 多聚核苷酸激酶 1.催化反应类型 1)激酶活性（5-磷酸化酶）：可将ATP中的位的磷酸基转移到ss-DNA，ds-DNA和RNA分子的5-羟基端 2) 3

29、-磷酸酶活性（pH 5-6） 2. 用途 1) 5-端末端标记 2) 分子克隆过程中以获得5-磷酸基末端，便于连接酶反应（四）末端脱氧核糖核苷酸转移酶(p58-59)（Terminal deoxynuclotidyl transferase) 催化dNTP加到DNA分子的3-OH末端，带3 突出的DNA为最佳受体。 应用 重组人工粘性末端 用于DNA 3端标记TUNEL凋亡检测重组人工粘性末端 DNA1DNA2dATPdTTPAAAAAAAAAATTTTTTTTTTAAAAATTTTTAAAAATTTTTdATPdTTP末端转移酶 七、核酸酶核酸外切酶RNaseRNas HS1核酸酶（一） 外切酶III（ExoIII） 1. 一般特点： 来自于，分子量28,000 kD 2. 催化反应类型 1) 外切酶活性：3 5，产生5-单磷酸核苷酸和具各种结构的 ds-DNA， 2) 核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子， 3) 3-磷酸酶活性：除去3-磷酸基后形成3-OH端，有利于DNA聚合酶反应， 4) 内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切