03-水的细菌学检查

1、水的细菌学检查微生物学实验1一、实验目的 1学习水样细菌总数的测定方法。 2掌握水中大肠菌群的测定方法。 3了解大肠菌群的数量与生活饮用水的 重要性。 2生活用水的水源常被生活污水或工业废水或人与动物的粪便所污染，可能含有不同类型的微生物，有腐生性的和病原性的。腐生性微生物对人无害，而病原性微生物则能引起传染病的发生。必须对生活用水及其水源进行严格的细菌学检查。 测定水样是否合乎饮用标准，通常包括下列两个项目： 细菌总数测定 大肠菌群的测定 3细菌总数测定 水中细菌总数可说明被有机物污染的程度。细菌数越多，有机物质含量越大。肠道中的绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养基

2、上进行生长，出现肉眼可见的菌落。 细菌总数是指1 ml水样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，经37、24小时培养后，所生长的菌落数。 我国规定1 ml自来水中的总菌数不得超过100个。 二、实验原理4大肠菌群的测定 若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中容易死亡与变异，因此数量较少，要从中特别是自来水中分离出病原菌常较困难与费时，这样就要找到一个合适的指示菌，此指示菌要求是大量出现在粪便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是较易检出的。 5若指示菌在水中不存在或数量很少，则大多数情况也保证没有病原菌。最广泛应用的指示菌是大肠菌群(coliform group)。大肠菌群的定

3、义：一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽孢的杆状细菌，并在乳糖培养基中，经37 2448 h培养能产酸产气。根据水中大肠菌群的数目来判断水源是否被粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。 6我国规定每升自来水中大肠菌群不超过3个；若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升不得超过1,000 个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，其大肠菌群数平均每升不得超过10,000 个7检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。多管发酵法使用历史较久，又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用；滤膜法是一种快速的替代方法，而且结果重复性好，又能测定大

4、体积的水样，目前国内已有很多大城市的水厂采用此法。 8多管发酵法测定水中大肠菌群的原理 多管发酵法包括：初发酵试验、平板分离和复发酵试验三部分。91初发酵试验 液体培养基含有乳糖、蛋白胨和溴甲酚紫。 乳糖起选择性碳源的作用，大肠菌群可发酵乳糖产酸（有机酸），产气（CO2+H2）。 溴甲酚紫是pH指示剂（碱性条件：紫蓝色；酸性条件：黄色，变色点pH=6.7）。将水样接种在具倒置杜汉氏小管的发酵管内，于37下培养，24h后杜汉氏小管的顶端出现气泡，表明有气体产生，培养基混浊，颜色变黄，说明水中存在大肠菌群，视为阳性结果。10如有下列情况的出现，其结果判断需谨慎（1）个别其他类型的细菌在上述条件下也

5、可能产气，需进行下述试验（即平板分离和复发酵试验）才能进一步确证。 （2）培养24h后产酸，但未见产气者，不能立即判断为阴性结果，由于菌量少，也可能延迟至48h后才产气，应视为可疑结果，也需进行下述试验（即平板分离和复发酵试验）进一步确证，48h后仍不产气，可判断为阴性结果。 112平板分离 平板分离用培养基通常为：伊红美蓝琼脂（eosin methylene blue agar， EMB agar），复红亚硫酸钠琼脂（亦称远藤氏培养基Endos medium）。12（1）伊红美蓝琼脂培养基中含有伊红与美蓝这两种苯胺类染料，它们不但可以抑制G+菌和一些难培养的G-菌，而且在低酸度时，两种染料结

6、合形成沉淀，起着产酸指示剂的作用。大肠菌群因其强烈发酵乳糖而产生大量的混合酸，使菌体表面带上正电荷，可染上伊红染料，伊红与美蓝结合，菌体被着上深紫色，在含有两种染料呈紫色的培养基上，形成带核心、具金属光泽的菌落。 13深紫黑色、有金属光泽。紫黑色、不带或略带金属光泽。淡紫红色、中心颜色较深。在伊红美蓝这种鉴别性培养基上，大肠菌群呈现特征性菌落，因此，凡是出现这种菌落可确认为是大肠菌群。14（2）复红亚硫酸钠培养基中含有碱性复红染料，大肠菌群发酵乳糖产生的有机酸和乙醛与复红反应形成深红色复合物，菌落呈现带金属光泽的深红色。培养基中的亚硫酸钠可使复红脱色，培养基为淡粉红色，同时还可抑制其他杂菌生长

7、。在这种鉴别性培养基上，大肠菌群也呈现特征性菌落。1524h和48h产酸产气的初发酵菌落均需在上述培养基中的一种，进行平板划线，分离出阳性菌落。 3复发酵试验 阳性菌落经涂片染色鉴别为G-，无芽孢者，再经过乳糖蛋白胨液体培养基进行复发酵试验，经24h培养产酸产气者，可确认为大肠菌群阳性结果。16三实验用品 培养基： 乳糖蛋白胨液体培养基 3倍浓缩乳糖蛋白胨液体培养基 伊红美蓝琼脂培养基（制成平板） 17四、实验操作 （一）细菌总数的测定 1. 水样采集自来水 将自来水龙头用火焰烧灼3 min灭菌，再拧开水龙头流水5 min，以排除管道内积存的死水，随后用已灭菌的三角瓶接取水样，以供检测。池水、

8、河水或湖水将无菌的带玻塞的小口瓶浸入距水面1015 cm深的水层中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中装满后，盖好瓶塞，取出后立即进行检测，或临时存于冰箱，但不能超过24 h。18 2.细菌总数的测定 (1)自来水 (2)池塘水、河水或湖水 水样稀释 吸取稀释后水样加入平板 向平皿内倾注培养基(1520 mL) 37温箱，倒置培养24h，进行菌落计数 193.菌落计数方法 （1）计算相同稀释度的平均菌落数 。（2）选择平均菌落数在30300之间稀释度的平板。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘以稀释倍数，作为该水样的细菌总数进行报告。 20 （3）若有两个稀释度的平均菌落

9、数均在30300之间，则按两个稀释度菌落总数的比值来决定取数。如比值小于2，应取两者的平均数；如比值大于2，则取其中较小的菌落总数进行报告。（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数进行。 21（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告。（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告。 22四、实验操作 （二）多管发酵法测定水中的大肠菌群 1. 水样采集 2. 自来水检查 （1）初（步）发酵试验 （2）平板分离 （3）复发酵试验 2324100ml

10、水量的阳性管数10ml水量的阳性管数Ol2每升水样中大肠菌群数每升水样中大肠菌群数每升水样中大肠菌群数023025四、实验操作 （二）多管发酵法测定水中的大肠菌群 1. 取池塘水、河水或湖水等的检查 （1）将水样稀释成10-1 与10-2 。（2）吸取稀释后水样 。26（2）分别吸取1mL l0-2、10-1的稀释水样和1mL原水样，各注入装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10mL和100mL原水样，分别注入装有5mL和50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。（3）平板分离和复发酵试验。 27五、实验结果 池水、河水或湖水阳性结果记“+”；阴性结果记“-”。 查表2-14得每升水样中