山大微生物学学习指导

1、PAGE PAGE 69山东大学微生物学学习指导第1章： 绪论重点与难点剖析1、微生物及其共性微生物的研究对象以及它们区别于其他生物的特征（微生物的共同特征）微生物：是肉眼看不清、微小生物的统称。其研究对象包括：病毒、古菌、细菌、真菌、许多单细胞藻类和原生动物。其中病毒属于非细胞类特殊类群，古菌和细菌属于原核生物， 真菌、,单细胞藻类和原生动物属于真核生物。微生物以其独特的共性特征而区别于其他生物，归纳为五大共性：（1）体积小, 结构简单，表面积/体积比值大;（2）代谢活力强, 吸收多, 转化快;（3）生长旺, 繁殖快;（4）分布广, 种类多（多样性）;（5）适应性强, 易变异。体积小、比表面

2、积大特别有利于它们和周围环境进行物质、能量、信息的交换。微生物的其它很多属性都和这一特点密切相关。微生物的主要特征贯穿于基础微生物教学的各个章节中。2、微生物学(Microbiology)微生物学是研究微生物以及其独特的相关研究技术的科学。3、微生物的发现1676年，微生物学的先驱荷兰人列文虎克（Antony van leeuwenhoek）首次观察到了细菌。列文虎克的兴趣和爱好就是利用业余时间制造显微镜，并具有高超的使用技术。据说他曾制作过400多架单式显微镜和放大镜，放大率一般为50200倍。4、微生物学的建立（巴斯德与柯赫对微生物学发展的重要作用与意义-奠基者）法国人巴斯德（Louis

3、Pasteur）（18221895）和德国人柯赫（Robert Koch）（ 18431910）被誉为微生物学的奠基人，是由于他们伟大的贡献。他们的工作为今天的微生物学奠定了科学原理和基本的方法。1)、巴斯德的主要贡献及意义：巴斯德开辟了微生物领域，并以倡导疾病细菌学说、发明预防接种方法而闻名，具体贡献为：(1) 以著名的曲径瓶试验彻底否定了“自然发生”学说；巴斯德简单而完美的实验奠定了一种科学而理性的基础，表明微生物可以通过理性的科学的方法进行研究。自生说被否定的意义之一是：既然不是自生的，就必然已经存在，人们就可以去探索它，寻找它。由此将微生物的探索方法由一项科学性观察转向成了一项实验科学

4、，打开了研究感染性疾病病因的方法之门。 (2) 在免疫学的预防接种方面，发现传染疾病的微菌，在特殊的培养之下可以减轻毒力，变成防病的药苗。首次制成狂犬疫苗； (3) 发现并证实发酵是由微生物引起的；(4)其他贡献，如巴斯德消毒法等2)、柯赫的主要贡献及意义对病原细菌的研究作出了突出的贡献：包括具体证实了炭疽杆菌是炭疽病的病原菌；发现了肺结核病的病原菌（1905年获诺贝尔奖）；提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则 著名的柯赫原则，即 = 1 * GB3 在每一相同病例中都出现这种微生物； = 2 * GB3 要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中培养出来； = 3 * GB3 用这

5、种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生； = 4 * GB3 从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。微生物学基本操作技术方面的贡献包括：细菌纯培养方法的建立；设计了各种培养基，实现了在实验室内对各种微生物的培养；流动蒸汽灭菌；染色观察和显微摄影等技术。柯赫根据巴斯德的工作，证明了微生物是疾病的原因，并进一步表明：特定的疾病是由特定的微生物引起的。进一步将微生物研究推向更高的一种科学水平上，形成了疾病确定的“柯赫原则”。与此同时柯赫还向微生物学贡献了一系列研究技术。“柯赫原则”以及柯赫发明的纯培养技术，促进了微生物学的极大发展。5、微生物学的发展及贡献 (1)多学科

6、交叉促进微生物学全面发展，使微生物学发展成为生命科学领域内一门发展最快，影响最大、体现生命科学发展主流的前沿科学。 (2)微生物学推动生命科学的发展。.促进许多重大生命理论问题的突破；对生命科学研究技术的贡献，如细胞的人工培养、突变体筛选、DNA重组技术和遗传工程、.微生物与人类基因组计划等。 第2章： 纯培养技术和显微技术重点与难点剖析一、 纯培养技术1、分离获得微生物的纯培养物是研究利用微生物的基础。获得纯培养物涉及的相关技术包括：无菌技术、 微生物的分离与分离纯化技术和微生物培养和保藏技术。 2、无菌技术：包括培养基和物品的各种灭菌技术和微生物各种接种过程的无菌操作技术等。重点在实验课中

7、掌握相关的技术原理和操作规范，以牢固树立“无菌”的思想和概念。3、固体培养基分离纯培养物的基本方法和原理纯培养指的是只有一种微生物组成的细胞群体。自然环境中微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物的基本原理：首先采用方法将单个的细胞与其他细胞分离开，进而提供细胞合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。进行微生物的分散主要采用稀释的方法，而固体培养基由于能够使分散的细胞固着于一定的位置，与其他的细胞分离，从而生长成为一个单细胞来源的群体-即纯培养，而成为常用而简便的分离介质和营养介质。固体培养基分离纯培养物由于稀释方法的差异和接种平板的方式差异而分为以下几种方法：（1）划线平板法将合适的无菌

8、培养基倒入无菌培养皿中，冷却后制备成平板，按以下方法划线：平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中，产生的单个细胞在培养基表面生长的后代就是纯培养物。（2）倾注平板法和涂布平板法这两种方法的共同点就是在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，最常用的液体稀释方法为10倍系列稀释，参考下图：随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。稀释倾注平板法的操作是：选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液与灭完菌冷却到50-55C的培养基混合均匀，一起倒入无菌培养皿中，冷却形成平板后，培养。稀释倾注平板法操作较麻烦。在进行微生物分离纯化

9、时，该方法需要样品与热的培养基混合，因此对热敏感微生物的影响明显；该方法操作过程中，样品中的微生物有的分布于平板表面，有的则裹在培养基中，后者则会影响严格好氧微生物的生长；而且，对于同一种微生物，平板表面的菌落形态与培养基内的菌落形态会存在着明显的差别，影响菌落形态的判别。在进行微生物计数时，该方法细胞分散均匀，计数较准确。稀释涂布平板方法的操作是：首先将灭完菌冷却到50-55C的培养基倒入无菌培养皿中冷却形成平板，然后选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液加到平板中央，以三角刮刀将之均匀地涂布于整个平板上，培养。稀释涂布平板方法操作相对简单，它克服了倾注平板方法对热敏感微生物、严格好氧微生物和

10、培养基内部菌落带来的不利影响，是实验室中经常使用的常规分离方法。其存在的问题是有时会由于菌液太多或者涂布不均匀而使细胞分散不充分，影响计数结果和分离纯化效果。（3）稀释摇管法主要用于厌氧微生物的分离纯化，是稀释平板法的一种变通。其基本操作流程为：试管培养基融化 50度保温 样品梯度稀释后加入试管培养基中 摇匀冷却凝固 石蜡油封闭 培养。细胞固着于试管的琼脂柱中，再加以石蜡覆盖，就可以进行厌氧菌的分离纯化。由于氧的存在对严格厌氧微生物有毒害作用，因此严格厌氧菌的培养往往需要专业的厌氧操作设备。因此，稀释摇管法在虽然观察和挑取菌落时比较困难，但是在缺乏专业设备的条件下，此法仍是一项方便有效地进行厌

11、氧微生物分离、纯化和培养的低成本方法。所有以稀释为基础达到分离纯培养物的方法，其前提条件是该类群的微生物细胞必须在群体中占有数量上的优势，才能够在不断的稀释中不被淘汰而保留下来。4、液体培养基分离纯培养的原理液体培养基分离纯培养物仍然基于稀释的基本原理，但是需要高度稀释，致使一支试管中分配不到一个微生物细胞，至多只有一个细胞，这样才能够在液体培养基中获得纯培养物。因此根据统计学原理，采用稀释法进行液体分离纯培养物时，必须要求在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）试管中表现为不生长，这时表现为生长的试管中为纯培养的可能几率就增大（据统计计算，若同一稀释度的试管中有95%表现为

12、不生长，在有细菌生长的试管中培养物来源于一个细胞（即纯培养）的几率为97.5%。来源于两个细胞的几率为2.44%，来源于三个细胞的几率为0.04%）5、选择培养分离与富集培养所有以稀释为基础达到分离纯培养物的方法，其前提条件是该类群的微生物细胞必须在群体中占有数量上的优势，才能够在不断的稀释中不被淘汰而保留下来。非数量优势微生物类群的分离纯化则可以首先通过选择培养与富集培养的方式使其数量增加，成为数量优势菌群后，再通过上述各种平板法进行分离和纯化。选择培养就是通过添加抑制剂，抑制大多数其它微生物的生长；或者选择特定的营养物，使得需要的微生物易于快速生长。没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然

13、界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。富集培养就是利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。 6、 微生物的保藏技术性状稳定的菌种纯培养物是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异 b）污染 c）死亡 基本要求：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱。基本方法：生活态: 培养基传代培养(斜面、平板、半固体); 寄主传代培养 休眠态 冷冻(液氮、低温冰箱); 干燥(沙土管、冷冻真空干燥)其它方

14、法：滤纸片;明胶片;蒸馏水对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。二、显微技术 由于微生物微小，多数肉眼无法看见，因此对于微生物世界的认识必须借助于显微技术。显微技术不仅与显微镜自身的原理和特点有关，也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术。因此显微技术是微生物学的重要内容之一，在了解各种显微工具及其原理和应用优势后，还必须紧密结合试验课程熟练掌握微生物学研究的常规显微工具。 1、显微镜的分辨率显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨率（Resolution）有关， 它是决定观察效果的

15、最重要的指标。分辨率（力)（Resolution，R) 指的是显微镜能够分辨两点之间最小距离能力。能够分辨的距离越小，分辨率越高，反之越低。依据德国理学家Ernst Abbe，在19世纪70年代建立的在Abbe的公式中，两物体之间的最小可分辨距离被称为最小距离（d）0.5 最小可分辨距离： d = n sin 公式解析：（l）所用光源的光波波长（），是影响最小可分辨距离的最主要因素。可见光光线的波长为400-700nm，其中蓝光的波长最短（400-500nm），最小可分辨距离最小，所提供的分辨率最高（所以为什麽大多数显微镜的滤光片都是蓝色的）。（2）: 为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和

16、工作距离。（3）n：玻片（样品）与物镜间介质的折射率(空气：干燥物系；香柏油：油浸物系)。（4）n sin : 被称为数值口径（Numerical Aperture, NA)，它是决定物镜性能的最重要的指标。分辨率从定义上讲，与可分辨的最小距离（d）成反比，可表示为：（）。以这种方式将最小可分辨距离与分辨率作为两个概念分开理解，比较容易理解提高分辨率的相关措施（获得最小分辨距离 提高分辨率）：（1）减短光波波长（）。（2）增加镜口角(),这是增加数值口径的因素之一。（3）增加介质的折射率(n)，这是增加数值口径的重要因素。如，利用油镜进行显微观察时，以香柏油取代空气，其重要作用就是提高介质折射

17、率，使数值口径和分辨率均得到提高，同时香柏油与玻璃的折射率相近，使得很多原来在透镜和载玻片表面因折射和反射而损失的光线可以进入物镜，提高照明亮度，改善观察效果。2、明视野显微镜明视野显微镜即常用的普通光学显微镜，其照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的，不易看清。解决的措施，一方面是对观察的样品进行改造，发展出各种染色技术，通过特殊的染色方法使细胞着色，增加与背景的反差，便于观察；另一方面进行显微镜的改造，由此发展出不同种类的显微镜，适用于不同的观察目的。3、暗视野显微镜 暗视野显微镜则利用特殊的聚光器遮挡中心光源，实现斜射照明，使照射到样品上的透射光线无法进

18、入物镜，但由样品反射或折射的光线进入物镜，因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的，由此达到增加反差，便于观察的目的。并且，使用暗视野显微镜，即使所观察微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，仍然可以发现其存在。4、相差显微镜光波的长短表现为颜色差别，光的振幅高低表现为明亮程度的不同。观察样品各部分厚薄、密度不同，光线通过时直射光和衍射光的光程产生差别，导致出现相位差。相差显微镜配备了特殊的光学装置，利用光的干涉现象，将光的相位差转变成人眼可辨的振幅差（明暗差），形成反差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见，因此相差显微镜很适合观察活的细胞以及细胞内的一些细微结构。相差显微镜实现这一目的的

19、特殊的光学装置主要是环状光圈和相板。5、荧光显微镜紫外线光源照射在具有荧光素的样本上，荧光素激发出荧光，使标本在暗的视野中显现出光亮的物体，不同的荧光素还表现为不同的颜色，由此可以进行定性和定量的研究。主要应用于免疫学、环境微生物学和分子生物学等方面。6、电子显微镜透射电子显微镜与扫描电子显微镜电子显微镜与光学显微镜的差异：1） 以电子波(波长最短可达到0.005 nm)代替光源，由于波长的极大缩短而大大提高了分辨率。光镜的最高分辨率可达到0.2m，这种局限是由可见光的性质决定的，与显微镜自身的性能无关。电镜实际的分辨率比光镜提高约1000倍。2）电镜镜筒中要求高真空（在电子的运行中如遇到游离

20、的气体分子会因碰撞而发生偏转，导致物象散乱不清）。电子显微镜因需在真空条件下工作，所以很难观察活的生物。3）以电子透镜（电磁圈）代替光学透镜，通过电磁圈使电子“光线”汇聚、聚焦。4）电子像人肉眼看不到，需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。 电子显微镜按结构和用途可分为：透射电子显微镜(transmission electron microscope): 电子束穿过薄切片扫描电子显微镜(scanning electron microscope): 观察样品的表面结构 7、扫描隧道显微镜是目前分辨率最高的显微镜，其横向分辨率可以达到0.1-0.2 nm，纵向分辨率可以达到0.001 nm，足以 HY

21、PERLINK file:/C:Documents%20and%20Settingsgroup3微生物学电子版教材WSWX02eo22-1O.htm t _blank 对单 HYPERLINK file:/C:Documents%20and%20Settingsgroup3微生物学电子版教材WSWX02eo22-1O.htm t _blank 个的原子进行观察。由于在扫描时不接触样品，又没有高能电子束轰击，因而可以避免样品的变形。不仅可以在真空，而且可以在保持样品生理条件的大气及液体环境下工作， 所以对生命科学研究领域具有十分重要的意义。 8、细菌染色法由于微生物细胞微小，含水量多，因此在光学

22、显微镜下为透明状态，与背景没有反差，无法进行观察，因此通过各种染色方法提高其反差。细菌菌体(等电点一般pH 2-5)在中性碱性或弱酸性溶液中带负电荷，易于碱性染料(正电荷)进行结合，所以常用碱性染料进行染色。常见碱性染料:结晶紫，番红，美蓝，孔雀绿；中性红等。常用的染色方法：染色操作的基本程序为：制片干燥固定染色水洗干燥镜检革兰氏染色（C.Gram于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。）结晶紫初染 碘液媒染 酒精脱色番红复染 第3章：微生物细胞的类群、形态、结构与功能原核微生物重点与难点剖析1、微生物的主要类群：2、原核微生物指细胞核无核膜包裹，只存在由裸露DNA组成的核区（nuc

23、lear region) 的原始单细胞生物。主要类群包括细菌与古生菌。细菌又称真细菌（eubacteria），包括普通细菌、放线菌、蓝细菌、 支原体、立克次氏体和衣原体等 (三菌三体）。古生菌，在进化谱系上与真细菌及真核生物相互并列，且与后者关系更近，而其细胞构造却与真细菌较为接近，同属于原核生物。3、细菌细胞的基本形态基本形态：球状、 杆状、螺旋状和其他形状。球状菌：细胞个体呈球形或椭圆形，球菌在细胞分裂时形成的不同空间排列方式，常被作为分类依据。杆状菌：细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较稳定，可作为分类依据；而长度和排列方式常因生长阶段和培养条件不同而发生较大变化，一般不作为分类依

24、据。螺旋状：包括（1）弧菌，其菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。（2）螺菌, 菌体回转如螺旋，螺旋数目和螺距大小因种而异(1-20)。鞭毛二端生。细胞壁坚韧，菌体较硬。（3）螺旋体菌,菌体柔软，螺旋数目因种而异(3-70)。用于运动的类似鞭毛的轴丝位于细胞外鞘内。其它形状：包括柄杆菌、星形细菌、方形细菌及各种条件下细胞正常发育受阻而产生的异常形态4、细菌细胞的大小一般细菌大小的度量单位为微米（micrometer, m）， 目前发现的细菌中最小的与无细胞结构的病毒相仿（约50 nm）；最大的肉眼可见（0.75 mm）。一般细菌的大小范围：球菌，0.5 1m （直

25、径）；杆菌0.2 1m （直径） 1 80m（长度）；螺旋菌0.3 1 mm （直径） 1 50 mm（长度）(长度是菌体两端点之间的距离，而非实际长度)。5、细菌细胞的基本结构6、细胞壁的主要功能固定细胞外形和提高机械强度，从而使其免受渗透压等外力的损伤。为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需。失去了细胞壁的原生质体，也就丧失了这些重要功能；阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质（分子量大于800）进入细胞，保护细胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物质的损伤；赋予细菌具有特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性。7、革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）细菌细胞壁的化学组成和结构特点革兰氏阳

26、性（G+）菌细胞壁特点：厚度大（2080nm），化学组分简单，一般只含90%肽聚糖和10%磷壁酸。肽聚糖是真细菌细胞壁中的特有成分。磷壁酸为革兰氏阳性细菌细胞壁中特有的一种酸性多糖。革兰氏阴性（G-）细菌细胞壁特点结构分为肽聚糖层和外膜层。其特点是肽聚糖层薄 (2-3nm)，层次多，化学组分复杂，强度低。8、肽聚糖单体的化学组成和结构肽聚糖单体中的化学组成：双糖单位，由由N-乙酰胞壁酸（ NAM or M ）和 N-乙酰葡萄糖胺（ NAG or G ）l两种单糖之间以-1,4-糖苷键 M(1)-G(4)连接形成。该糖苷键很容易被溶菌酶 (lysozyme) 所水解，从而引起细菌因肽聚糖细胞壁的

27、“散架”而死亡。双糖单位是肽聚糖中糖链骨架的基本结构单位。四肽侧链，由四个氨基酸分子按L型与D型交替方式连接而成，连接于糖骨架的N-乙酰胞壁酸分子上。肽桥连接一条肽侧链的4位氨基酸和另一条肽侧链的3位氨基酸，变化多样，是不同微生物肽聚糖多样性的基础。目前所知的肽聚糖已超过100种，主要的变化发生在肽桥上。（附结构示意图）9、磷壁酸革兰氏阳性细菌细胞壁上特有的化学成分，主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。膜磷壁酸(又称脂磷壁酸)跨越肽聚糖层并与细胞膜相交联的，由甘油磷酸链分子与细胞膜上的磷脂进行共价结合后形成。其含量与培养条件关系不大。可用45%热酚水提取，也可用热水从脱脂的冻干细菌中提取。壁磷壁酸

28、，它与肽聚糖分子间进行共价结合，含量会随培养基成分而改变，一般占细胞壁重量的10%，有时可接近50%。用稀酸或稀碱可以提取。磷壁酸的主要生理功能 (p41) 其磷酸分子上较多的负电荷可提高细胞周围Mg2+的浓度，进入细胞后就可保证细胞膜上一些需Mg2+的合成酶提高活性；贮藏磷元素；增强某些致病菌如A族链球菌(Streptococcus)对宿主细胞的粘连、避免被白细胞吞噬以及抗补体的作用；赋予革兰氏阳性细菌以特异的表面抗原；可作为噬菌体的特异性吸附受体；能调节细胞内自溶素(autolysin)的活力，借以防止细胞因自溶而死亡。因为在细胞正常分裂时，自溶素可使旧壁适度水解并促使新壁不断插入，而当其

29、活力过强时，则细菌会因细胞壁迅速水解而死亡。10、革兰氏阴性细菌的细胞壁 （1） 肽聚糖它的肽聚糖埋藏在外膜层之内，是仅由12层肽聚糖网状分子组成的薄层(23nm)，含量约占细胞壁总重的10%，故对机械强度的抵抗力较革兰氏阳性菌弱。 四肽尾的第3个氨基酸不是L-lys，而是内消旋二氨基庚二酸(m-DAP),一种只有在原核微生物细胞壁上才有的氨基酸。没有特殊的肽桥，其前后两个单体间的连接仅通过甲四肽尾的第4个氨基酸D-ala的羧基与乙四肽尾的第3个氨基酸mDAP的氨基直接相连 ,只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套。 （2）外膜位于革兰氏阴性细菌细胞壁外层，由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若干种蛋白

30、质组成的膜，有时也称为外壁。a 脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚（810nm）的类脂多糖类物质，由类脂A、核心多糖(core polysaccharide)和O-特异侧链（O-specific side chain，或称O-多糖或O-抗原）三部分组成。Man, mannose, 甘露糖Abe, abequose, -脱氧岩藻糖Rha, rhamnose,鼠李糖Gal, galactose, 半乳糖Glu, glucose, 葡萄糖GluNac, N-acetylglucosamine, N-乙酰葡萄糖胺Hep, heptoses,

31、庚糖KDO, 2-keto-3-deoxyotonate, 2-酮-3-脱氧辛酮酸 脂多糖的主要功能 LPS结构的多变，决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性；因其负电荷较强，故与磷壁酸相似，也有吸附Mg2+、Ca2+等阳离子以提高其在细胞表面浓度的作用； 类脂A是革兰氏阴性细菌致病物质内毒素的物质基础；是许多噬菌体在细胞表面的吸附受体； 具有控制某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能；可透过若干种较小的分子（嘌呤、嘧啶、双糖、肽类和氨基酸等），但能阻拦溶菌酶、抗生素（青霉素等）、去污剂和某些染料等较大分子进入细胞膜。 b 外膜蛋白(outer membrane protein)嵌合在L

32、PS和磷脂层外膜上的蛋白。有20余种，但多数功能尚不清楚。孔蛋白（porins）是由三个相同分子量（36000）蛋白亚基组成的一种三聚体跨膜蛋白，中间有一直径约1nm的孔道，通过孔的开闭，可对进入外膜层的物质进行选择。非特异性孔蛋白：可通过分子量小于800900的任何亲水性分子特异性孔蛋白：只容许一种或少数几种相关物质通过，如维生素B12和核苷酸等。C 周质空间(periplasmic space, periplasm) 又称壁膜间隙。在革兰氏阴性细菌中，一般指其外膜与细胞膜之间的狭窄空间（宽约1215nm），呈胶状。周质空间是进出细胞的物质的重要中转站和反应场所在周质空间中，存在着多种周质蛋

33、白(periplasmic proteins)：水解酶类；合成酶类；结合蛋白；受体蛋白；周质空间：壁膜间隙，也有观点认为革兰氏阳性细菌中同样存在。11、古细菌的细胞壁特点在古生菌中，与真细菌类似功能但化学成分差别甚大的细胞壁。已研究过的一些古生菌，它们细胞壁中没有真正的肽聚糖，而是由多糖（假肽聚糖）、糖蛋白或蛋白质构成的。因此，古生菌类群细胞壁成份多样，差异大。 （1）假肽聚糖(pseudopeptidoglycan)细胞壁：代表菌甲烷杆菌属( Methanobacterium )。（2）独特多糖细胞壁：代表菌甲烷八叠球菌( Methanosarcina )（3）硫酸化多糖细胞壁：代表菌盐球菌

34、（Halococcus）（4）糖蛋白(glycoprotein)：代表菌盐杆菌属( Halobacterium)（5）蛋白质细胞壁： 有的是由几种不同蛋白组成，如甲烷球菌( Methanococcus )和甲烷微菌( Methanomicrobium )；有的则由同种蛋白的许多亚基组成， 甲烷螺菌属( Methanospirillum )。12、缺壁细菌（1）L型细菌（L-form of bacteria）：细菌在某些环境条件下（实验室或宿主体内）通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷变异型。因英国李斯德（Lister）预防研究所首先发现而得名（1935年，念珠状链杆菌 Streptoba

35、cillus moniliformis）大肠杆菌、变形杆菌、葡萄球菌、链球菌、分枝杆菌和霍乱弧菌等20多种细菌中均有发现，被认为可能与针对细胞壁的抗菌治疗有关。特点：没有完整而坚韧的细胞壁，细胞呈多形态；有些能通过细菌滤器，故又称“滤过型细菌”；对渗透敏感，在固体培养基上形成“油煎蛋”似的小菌落（直径在0.1mm左右）；（2）原生质体（protoplast）在人为条件下，用溶菌酶处理或在含青霉素的培养基中培养而抑制新生细胞壁合成而形成的仅由一层细胞膜包裹的，圆球形、对渗透压变化敏感的细胞，一般由革兰氏阳性细菌形成。特点：对环境条件变化敏感，低渗透压、振荡、离心甚至通气等都易引起其破裂；比正常有

36、细胞壁的细菌更易导入外源遗传物质，是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料。（3）球状体(sphaeroplast) ，又称原生质球采用上述同样方法，针对革兰氏阴性细菌处理后而获得的残留部分细胞壁（外壁层）的球形体。与原生质体相比，它对外界环境具有一定的抗性，可在普通培养基上生长。（4）枝原体(Mycoplasma)在长期进化过程中形成的、适应自然生活条件的无细胞壁的原核生物。因它的细胞膜中含有一般原核生物所没有的甾醇，所以即使缺乏细胞壁，其细胞膜仍有较高的机械强度。13、细菌细胞膜的特点细胞质膜是紧贴在细胞壁内侧、包围着细胞质的一层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜，厚约78nm，由磷脂

37、（占20%30%）和蛋白质（占50%70%）组成。膜蛋白包括具运输功能的整合蛋白）或内嵌蛋白；具有酶促作用的周边蛋白或膜外蛋白等。细菌细胞膜是一个重要的代谢活动中心，其膜蛋白约占细菌细胞膜的50%70%，比任何一种生物膜都高，而且种类也多。真核生物细胞膜中一般含有胆固醇等甾醇，含量为5%-25%。原核生物与真核生物的最大区别就是其细胞膜中一般不含胆固醇，而是含有（hopanoid）。由磷脂分子形成的双分子膜中加入甾醇类物质可以提高膜的稳定性14、细菌细胞膜的生理功能选择性地控制细胞内、外的营养物质和代谢产物的运送；是维持细胞内正常渗透压的屏障；合成细胞壁和糖被的各种组分（肽聚糖、磷壁酸、LPS

38、、荚膜多糖等）的重要基地；膜上含有氧化磷酸化或光合磷酸化等能量代谢的酶系，是细胞的产能场所；是鞭毛基体的着生部位和鞭毛旋转的供能部位.15、古生菌的细胞质膜重点在于其独特性和多样性在本质上也是由磷脂组成，但它比真细菌或真核生物具有更明显的多样性。 亲水头（甘油）与疏水尾（烃链）间是通过醚键而不是酯键连接的； 组成疏水尾的长链烃是异戊二烯的重复单位（如四聚体植烷、六聚体鲨烯等），它与亲水头通过醚键连接成甘油二醚（glycerol diether）或二甘油四醚(diglycerol tetraether)等，而在真细菌或真核生物中的疏水尾则是脂肪酸； 古生菌的细胞质膜中存在着独特的单分子层膜或单、

39、双分子层混合膜，而真细菌或真核生物的细胞质膜都是双分子层。具体地说，当磷脂为二甘油四醚时，连接两端两个甘油分子间的两个植烷（phytanyl）侧链间会发生共价结合，形成了二植烷(diphytanyl)，这时就形成了独特的单分子层膜（图3-12）。目前发现，单分子层膜多存在于嗜高温的古生菌中，其原因可能是这种膜的机械强度要比双分子层质膜更高。 在甘油的3C分子上，可连接多种与真细菌和真核生物细胞质膜上不同的基团，如磷酸酯基、硫酸酯基以及多种糖基等。 细胞质膜上含多种独特脂类。仅嗜盐菌类即已发现有细菌红素（bacterioruberin）、-胡萝卜素、-胡萝卜素、番茄红素、视黄醛（retinal）

40、，可与蛋白质结合成视紫红质(bacteriorhodopsin)和萘醌等。 16、细胞内储存物与其存在的意义聚-羟丁酸(poly-hydroxybutyrate, PHB)，类脂性质的碳源类贮藏物。它无毒、可塑、易降解,被认为是生产医用塑料、生物降解塑料的良好原料。多糖类贮藏物，包括糖原颗粒和淀粉颗粒。在真细菌中以糖原为多，糖原颗粒较小，不染色时需用电镜观察，用碘液染成褐色，可在光学显微镜下看到。有的细菌积累淀粉粒，用碘液染成深兰色。异染粒(metachromatic granules)，是无机偏磷酸的聚合物，一般在富磷的环境下形成，贮藏磷元素和能量，并可降低细胞的渗透压，用美兰或者甲苯胺兰染

41、色可呈现紫红色而得名。藻青素（cyanophycin），一种内源性氮源贮藏物，同时还兼有贮存能源的作用，通常存在于蓝细菌中。 硫粒（sulfur globules），在环境中还原性硫素丰富时，很多真细菌在氧化H2S，硫代硫酸盐时，常在细胞内形成折光性很强的硫粒，积累硫元素。当环境中环境中还原性硫缺乏时，可被细菌重新利用作能源。微生物储藏物的特点及生理功能： = 1 * GB3 不同微生物其储藏性内含物不同.例如厌气性梭状芽孢杆菌只含PHB，大肠杆菌只储藏糖原，但有些光和细菌二者兼有; = 2 * GB3 微生物合理利用营养物质的一种调节方式. 当环境中缺乏能源而碳源丰富时，细胞内就储藏较多的碳

42、源类内含物，甚至达到细胞干重的50%，如果把这样的细胞移入有氮的培养基时，这些储藏物将被作为碳源和能源而用于合成反应。 = 3 * GB3 储藏物以多聚体的形式存在，有利于维持细胞内环境的平衡，避免不适合的pH，渗透压等的危害。例如羟基丁酸分子呈酸性，而当其聚合成聚-羟丁酸（ PHB）就成为中性脂肪酸了，这样便能维持细胞内中性环境，避免菌体内酸性增高。 = 4 * GB3 储藏物在细菌细胞中大量积累，还可以被人们利用。 17、细菌芽孢（1）基本概念：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢（endospore或spore，偶译“内生

43、孢子”）。产芽孢的细菌多为杆菌，也有一些球菌。芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类和鉴定中的重要指标。（2）芽孢的构造 （3）芽孢的形成与萌发芽孢形成的7个阶段：轴丝形成；隔膜形成，产生前孢子；前孢子被吞没，双层膜形成，抗辐射力提高；皮层形成；芽孢衣形成；孢衣完成，折光性和抗热性增强-芽孢成熟；芽孢囊裂解，成熟芽孢释放。由休眠状态的芽孢变成营养状态细菌的过程，称为芽孢的萌发。包括 活化(activation)、出芽(germination)和生长(outgrowth)3个阶段。4）芽孢的耐热机制渗透调节皮层膨胀学说：芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差， 皮层的离子强度很高，产生极高的渗透

44、压夺取芽孢核心的水分，结果造成皮层的充分膨胀。皮层含水量约70%，核心部分的细胞质高度失水含水量极低（10%25%），因此，具极强的耐热性。其他学说：针对在芽孢形成过程中会合成大量的为营养细胞所没有的DPA-Ca，不少学者提出Ca2+与DPA的螯合作用会使芽孢中的生物大分子形成一种稳定而耐热性强的凝胶。总之，有关芽孢耐热机制是一个重要的有待进一步深入研究的基础理论问题。 5）伴孢晶体（parasporal crystal） 少数芽孢杆菌，例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体内毒素，称为伴孢晶体。它的

45、干重可达芽孢囊重的30%左右，由18种氨基酸组成。由于伴孢晶体对200多种昆虫尤其是鳞翅目的幼虫有毒杀作用。 6）芽孢研究意义 = 1 * GB3 芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类、鉴定中的重要形态学指标 = 2 * GB3 利用芽孢的耐热特性，提高芽孢产生菌的筛选效率 = 3 * GB3 芽孢是细菌的休眠体，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞；芽孢菌的长期保藏 = 4 * GB3 芽孢是抗逆性最强的生命体，是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。肉毒梭菌（Clostridium botulinum）产生肉毒素， pH7.0时在100下要煮沸5.09.5h； 115

46、下进行加压蒸汽灭菌，需1040min才能杀灭；121下则仅需10min。这就要求食品加工厂在对肉类罐头进行灭菌时，应掌握在121下维持20min以上。 破伤风梭菌(Clostridium tetani)产生破伤风毒素，121灭菌10min或115下灭菌30min才可。 18、糖被包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质，称为糖被。糖被按其有无固定层次、层次厚薄又可细分为荚膜、微荚膜、粘液层和菌胶团糖被的化学成分：荚膜的功能 保护作用：其上大量极性基团可保护菌体免受干旱损伤； 防止噬菌体的吸附和裂解； 一些动物致病菌的荚膜还可保护它们免受宿主白细胞的吞噬; 作为透性屏障或（和）离子交换系统

47、，可保护细菌免受重金属离子的毒害；贮藏养料，以备营养缺乏时重新利用；表面附着作用细菌糖被的研究意义糖被的有无及其性质的不同可用于菌种鉴定葡聚糖制备“代血浆”或葡聚糖生化试剂(如 “Sephadex”)；黄原胶(xanthan或Xc，又称黄杆胶，野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的胞外多糖，可用于石油开采、印染、食品等工业中；产生菌胶团的细菌在污水的微生物处理过程中具有分解、吸附和沉降有害物质的作用（活性污泥）。有些细菌的糖被也可对人类带来不利的影响。19、鞭毛（1）鞭毛: 生长在某些细菌体表的长丝状、波曲的蛋白质附属物，数目为一至数十条，具有运动功能。鞭毛的有无和着

48、生方式具有十分重要的分类学意义：单端鞭毛；端生丛毛；两端生鞭毛；周生鞭毛。P60（2）观察和判断细菌鞭毛的方法：电子显微镜直接观察 光学显微镜下观察：鞭毛染色和暗视野显微镜根据培养特征判断：半固体穿刺、菌落（菌苔）形态（3）鞭毛的结构：由基体、鞭毛钩和鞭毛丝三部分组成。革兰氏阳性细菌基体：L, P 和S-M环； 革兰氏阴性细菌基体：S-M环。在S-M环下方的Fli蛋白，起开关作用，控制鞭毛正转或者逆转，在S-M环旁侧的Mot蛋白，通过消耗能量，驱动S-M环的快速旋转。马达能量来源：细胞膜上的质子势。 鞭毛的生长方式是在其顶部延伸；鞭毛蛋白亚基螺旋状缠绕而成，每周为810个亚基。 20、放线菌的

49、基本概念放线菌（Actinomycetes）是具有菌丝、以孢子进行繁殖、高G+C/mol（60-72）、革兰氏染色阳性的一类原核微生物。 21、放线菌的形态与结构单细胞，大多由分枝发达的菌丝组成；菌丝直径与杆菌类似，约1mm；细胞壁组成与细菌类似，绝大多数革兰氏染色阳性；细胞的结构与细菌基本相同，按形态和功能可分为营养菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。1、营养菌丝(基内菌丝, 基丝, 初级菌丝体)：匍匐生长于培养基内，吸收营养，一般无隔膜，不断裂，直径0.2-0.8 mm，长度差别很大，有的可产生色素。2、气生菌丝(二级菌丝体)：营养菌丝发育到一定阶段，伸向空间形成气生菌丝，叠生于营养菌丝上，可覆盖

50、整个菌落表面。在光学显微镜下观察，颜色较深，直径较粗（1-1.4 mm），有的产色素。3、孢子丝：气生菌丝发育到一定阶段，其上可分化出形成孢子的菌丝，即孢子丝，又称产孢丝或繁殖菌丝。孢子丝形状和排列方式因种而异，常被作为对放线菌进行分类的依据。绝大部分菌具有生长发育良好的菌丝体，以孢子进行繁殖，菌落特征类似于霉菌。4、孢子：孢子形状有圆形、椭圆形、杆状或柱形, 不稳定； 孢子表面形状: 光滑、瘤状、鳞片状、刺状、毛发状，稳定。 孢子的形状、颜色和表面纹饰是分类的特征之一。22、放线菌的生长与繁殖孢子在适宜的条件下萌发，长出1-3个芽管，形成营养菌丝，渐次分化出气生菌丝和繁殖菌丝（孢子丝），孢子

51、丝释放孢子。23、放线菌的菌落形态能产生大量分枝和气生菌丝的菌种（如链霉菌）菌落质地致密，与培养基结合紧密，小而不蔓延，不易挑起或挑起后不易破碎。丝绒状，粉末状。不能产生大量菌丝体的菌种（如诺卡氏菌）粘着力差，粉质，针挑起易粉碎24、放线菌的分布特点及与人类的关系 = 1 * GB3 放线菌常以孢子或菌丝状态极其广泛地存在于自然界，土壤中最多，其代谢产物使土壤具有特殊的泥腥味。 = 2 * GB3 能产生大量的、种类繁多的抗生素（抗生素8000多种, 其中80%是由放线菌产生, 放线菌产生的90%由链霉菌产生）. = 3 * GB3 有的放线菌可用于生产维生素、酶制制；此外，在甾体转化、石油脱

52、蜡、烃类发酵、污水处理等方面也有应用. = 4 * GB3 少数寄生型放线菌可引起人、动物（如皮肤、脑、肺和脚部感染）、植物（如马铃薯和甜菜的疮痂病）的疾病。25、蓝细菌的基本概念蓝藻或蓝绿藻（blue-green algae），分布广泛，是一类含有叶绿素a、能以水作为供氢体和电子供体、通过产氧型光合作用将光能转变成化学能、同化CO2为有机物质的光合细菌。以前曾归于藻类，因为它和高等植物一样具有光和色素叶绿素a，能进行产氧型光合作用。原核，无叶绿体，70S核糖体，细胞壁中有肽聚糖（对溶菌酶敏感）。其形态学特点:1）具有原核生物的典型细胞结构，细胞壁构造相似于G 菌;2）形态差异极大，有球状、杆

53、状和丝状等形态；3）细胞中含有叶绿素a，存在于丰富的内膜系统上，进行产氧型光合作用；4）许多水生种类细胞质中有气泡，使菌体漂浮，保持在光线最充足的地方，以利光合作用。5）无鞭毛，但能在固体表面滑行，趋光性。6）分泌粘液层、荚膜或形成鞘衣，因此具有强的抗干旱能力。7）细胞中常有各种贮存物：糖原，聚磷酸盐，PHB，氮源（藻青素）。8）细胞的几种特化形式。蓝细菌细胞的几种特化形式异形胞（heterocyst）：一般存在于成丝状生长的种类中，位于细胞链的中间或末端，数目少而不定。光学显微镜下壁厚、色浅、多少中空的细胞，与邻近细胞间有孔道相同。固氮场所。静息孢子：厚壁细胞，休眠构造，可以萌发成营养体。链

54、丝段（hormogonia）：长形细胞断裂而成的短片段，具有繁殖功能。26、支原体、立克次氏体和衣原体支原体（Mycoplasma），立克次氏体（Rickettsia），衣原体（Chlamydia），革兰氏阴性细菌，其大小和特性均介于通常的细菌与病毒之间。（1） 支原体（Mycoplasma）不具细胞壁，只有细胞膜，细胞柔软；滤过性；对渗透压敏感(但其抗性大于去细胞壁的原生质体)；形态多变,小球状丝状；非常小,150nm300nm，勉强可在光学显微镜下看到； 细胞膜上有甾醇；可以自主生长(人工培养基可培养), 菌落“油煎蛋”形,小(= 0.11mm)；除肺炎支原体外，支原体一般不使人致病，但较

55、多的支原体能引起牲畜、家禽和作物的病害。（2）立克次氏体（Rickettsia）体内酶系不完全，是一类严格的活细胞内寄生的原核微生物； CW呈G 反应；细胞球状、球杆状，大小为0.3-0.60.8-2um, 光学显微镜下可见； 无滤过性。立克次氏体主要以节肢动物（虱、蜱、螨等）为媒介，寄生在它们的消化道表皮细胞中，然后通过节肢动物叮咬和排泄物传播给人和其他动物。有的立克次氏体能引起人类的流行性斑疹伤寒、恙虫热、Q热等严重疾病，而且立克次氏体大多是人兽共患病原体。（3）衣原体 (Chlamydia)介于立克次氏体与病毒之间，能通过细菌滤器，专性活细胞内寄生的一类原核微生物。过去误认为“大病毒”，

56、但它们的生物学特性更接近细菌而不同于病毒(细胞结构,同时含有DNA和RNA)。体内缺乏产能系统，专性活细胞内寄生的一类原核微生物，又称能量寄生物；CW呈G 反应； 细胞呈球形或椭圆形，直径0.2-0.3 um，有滤过性；在宿主细胞内生长繁殖具有独特的生活周期，即存在原体和始体两种形态。衣原体广泛寄生于人类、哺乳动物及鸟类，仅少数致病，如人的沙眼衣原体，鸟的鹦鹉热衣原体。有的还是人兽共患的病原体。1956年，我国微生物学家汤飞凡等应用鸡胚卵黄囊接种法，在国际上首先成功地分离培养出沙眼衣原体。现衣原体可用多种细胞培养。 支原体、立克次氏体、衣原体与细菌、病毒的比较第4章：微生物细胞的类群、形态、结

57、构与功能真核微生物重点与难点剖析1、真核生物凡是细胞核具有核膜、能进行有丝分裂、细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等细胞器的生物，称为真核生物。具有上述特征的微小生物，称为真核微生物。2、真核微生物类群及特点真核微生物包括真菌，单细胞藻类和原生动物。真菌的主要类群有酵母、霉菌和蕈菌。其中真菌的特点为：1.具有细胞核，进行有丝分裂；2.细胞质中含有线粒体但没有叶绿体，不进行光合作用，无根、茎、叶的分化；3.以产生有性孢子和无性孢子二种形式进行繁殖；4.营养方式为化能有机营养（异养）、好氧；5.不运动（仅少数种类的游动孢子有1-2根鞭毛）；6.种类繁多，形态各异、大小悬殊，细胞结构多样；2、酵母(

58、yeast)酵母菌是一群单细胞的真核微生物。通常指以芽殖或裂殖来进行无性繁殖的单细胞真菌，以区分霉菌。有些可产生子囊孢子进行有性繁殖。3、酵母的形态与结构个体细胞形态：卵圆、圆、圆柱、梨形等单细胞，其细胞直径一般比细菌粗10倍左右。有的酵母菌子代细胞连在一起成为链状，称为假丝酵母。其细胞的模式构造见下图：酵母的群体菌落形态：与细菌菌落类似，但一般较细菌菌落大且厚，表面湿润，膏状，易被挑起。菌落质地均匀，颜色一致。多为乳白色，少数呈红色，黑色（褐色）。一般有悦人的香味。4、酵母细胞壁结构酵母菌细胞壁的厚度为2570nm，重量约占细胞干重的25%，主要成分为葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和少量几丁质、少

59、量脂质。它们在细胞壁上自外至内的分布次序是甘露聚糖、蛋白质、葡聚糖。 蜗牛酶中含有纤维素酶，甘露聚糖酶，葡糖酸酶，几丁质酶和脂酶等30多种酶，可水解酵母菌细胞壁，制备酵母原生质体，或者水解子囊壁，释放子囊孢子。5、酵母的液泡液泡内含有一些水解酶代谢中间产物，金属离子，聚磷酸，类脂等物质； 其功能储存营养物， 如糖原和脂肪； 含有多种酶类， 如蛋白酶、核酸酶、纤维素酶等； 持细胞渗透压。6、酵母的生长繁殖（1）无性繁殖 = 1 * GB3 芽殖，是酵母主要的无性繁殖方式，成熟细胞长出一个小芽，到一定程度后脱离母体继续长成新个体。 = 2 * GB3 裂殖：少数酵母菌可以象细菌一样借细胞横割分裂而

60、繁殖，例如裂殖酵母。 = 3 * GB3 无性孢子：某些酵母菌可以产生芽孢子(假丝酵母), 掷孢子(掷孢酵母), 厚壁孢子(假丝酵母)等无性孢子进行繁殖。（2）有性繁殖酵母菌以形成子囊和子囊孢子的形式进行有性繁殖，其过程为： = 1 * GB3 两个性别不同的单倍体细胞靠近，相互接触； = 2 * GB3 接触处细胞壁消失，两个细胞的细胞质融合，称为质配； = 3 * GB3 两个细胞的细胞核融合，形成二倍体核，称为核配。二倍体核进行减数分裂时，形成4个或8个子囊孢子，而原有的营养细胞就成为子囊。子囊孢子萌发形成单倍体营养细胞。7、霉菌丝状真菌霉菌（mold）是一些“丝状真菌”的统称，不是分类