细胞爬片制备详细过程

1、【爬片的准备】.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小， 以备置于6孔板、12孔板或24孔板； 裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切 开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗 3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中

2、烘干后进行高压消毒。.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。【细胞爬片】.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻 片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可.待细胞贴壁后，可去上清加

3、含药培养基。.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镣子取出就可以了。如果要做诸如24h, 48h, 72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用 酒精灯火焰烧一下针头和镣子。末取出的可接着继续培养。【细胞爬片的固定】细胞爬片取出后，一般用 PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可 能会脱落。另外在保存细胞爬片的时候， 我一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸， 然后再放爬片，

4、 这样方便做实验时取片。 然后盖上盖子，并在盖子上做标记， 为避免混淆，可用透明胶带将 盖子和皿连在一起。一般 -20C保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。以下为常用的固定液.冷丙酮 可用于一般的免疫组化染色。将纯的丙酮预先放入冰箱 -20 C后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬 片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20 C （丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮 和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定 10分钟。取出后，室温吹干，然后放入 -20C保存。.多聚甲醛（常用4%）:可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细

5、胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇（CD）、主要组织相容性抗原等室温固定15分钟后，将表面体吹干，入 -20C保存。. 95%乙醇，可用于免疫组化。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度室温固定15分钟后，将表面体吹干，入 -20C保存。.甲醛（福尔马林）应用最广优点：形态结构保存好，且穿透性强，缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。细

6、胞爬片IHC实验步骤：.将已消毒的盖玻片（需要泡酸）置于培养皿中，按 2乘104/ml的细胞密度将细胞接种于 培养皿中进行细胞爬片，爬满后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。.PBS清洗标本 2次各15min。.4%多聚甲醛固定 15 min。.空气干燥 5min。.PBS清洗标本 2次各25min。.3%H2O2 孵育 15 min。. PBS清洗标本 3次 各2 min。.封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液）20min。.一抗孵育（PBS配，滴度1: 200,湿盒）4度 过夜或37度60 min。阴性对照最好用一 抗来源血清，否则用 PBS液. PBS清洗标本 3次 各5 min。13二抗

7、工作液孵育（湿盒）37O度30 min。.PBS清洗标本 3次 各5 min。. C 液（湿盒） 37 度 30 min。.PBS清洗标本 3次 各5 min。.DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约310min。.蒸储水洗 2次1 min。.苏木素复染 0.51min。.自来水洗 30min。.树胶封片，观察！有些朋友可能没做过 细胞爬片的免疫组化染色，等做起来就会发现想的和实际的相差很远，做爬片总是和想象中有差别，实际操作中有很多细节问题处理不好，前功尽弃。下面以我的失败和成功经验举例：第一，盖玻片需要过酸，并且自来水、蒸储水冲洗干净 。两张或者以上的玻片很容易因为虹 吸作用粘到一起，很容易

8、冲不干净，很容易把两张完全重叠在一起的玻片当成一张，一定要看清楚。晾干片子最好是在消毒饭盒中进行，饭盒底面放上纱布，将玻片斜靠在饭盒侧壁， 玻片正面不要接触纱布，否则会粘上毛毛的。然后高压蒸汽灭菌，烤箱中烤干。第二，爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。这一步至关重要，否则在后面用 PBS洗片时很容易将细胞洗掉。用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。第三，传代消化下来的细胞一定不要过多稀释，将浓一点的细胞悬液吹打混匀后

9、滴在玻片上，几个小时后再追加培养基。第四，玻片在培养皿中容易漂起，如果事先在皿中铺上液体很可能会不容易揭下来，或者揭下来时出印子在镜下很难看。漂起的玻片很容易两面都培养出细胞的，这时背面的细胞必须去除，挺难操作的，用 PBS冲洗可能会伤到正面的细胞，用小镣子夹玻片很容易夹碎，也很容易脱落，小心点好。第五，将玻片拿出后一定要记好哪边是正面，最好做玻片时将玻片切成长方形的。目前市场售的多为18mm x 18mm的盖玻片，或者24mmx24mm的盖玻片，正方形，很难分辨反正面， 在某个角上打个缺口， 对正方形是不中用的。可以用小砂轮切一下改成长方形，至于在某个角上用砂轮做个标记，理论上很简单，实际操

10、作有难度。第六，上面步骤都没问题后，玻片就需要进一步处理了，这里有几个细节，分述如下：1.PBS对玻片是冲洗还是浸泡， 我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏，每一步后都要冲洗 2-3 次，有时还没等试验做完，大部分细胞已经被冲掉了，呵呵！我当时欲哭无泪啊！2.4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4C的好，有人认为 37的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4C冰箱中。我发现直接用4 C的溶液会造成细胞冷休克，从片上脱落。.用中性树胶粘盖玻片与载玻片时，尽量少滴树胶，一点点就够了，而且至少半个小时以上 才能粘牢，防止在水中脱落。否则盖玻片就会移动，背面会出现树胶的

11、印子，镜下很难看， 而且擦不掉的。.固定好的片子放到冰箱中保存，我倒没怎么试过，我基本上做好的就直接做免疫组化。 细胞爬片的抗原修复1.为什么讨论抗原修复的问题？福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络， 也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。因此， 抗原修复也是影响免疫组化染色结果的基本因素。. schwann细胞爬片后，我用过4%的多聚甲醛，很好。是爬片，不是石蜡切片对吧，那就不 用抗原修复了。.我做过的是血管平滑肌细胞的爬片，当时一位临床病

12、理科的老师告诉我用70%乙醇固定，在4度固定12小时以上，做免疫组化比较好， 我做着效果还好。 关键是配多聚甲醛挺麻烦， 还要60度水浴才溶解，呵呵，本人就图个简单了。.不用抗原修复，用 1 % Triton PBS孵育可有助于暴露抗原。.我现在做的BAX和BCL-2是用丙酮固定，不需要抗原修复，可以直接做组化了 ，效果还可以. 5.细胞爬片用于免疫组化要不要脱蜡水化？要不要抗原修复啊？ ？因为细胞爬片本来就不用石蜡包埋，一般固定之后，可以冻于-20长期保存；实验时需要水化，一般20分钟左右；抗原修复不是必须的，因为细胞爬片要比组织切片抗原暴露好 和保存的好，所以不需要修复。但我看到过有的病理

13、老师做 Tunel时修复了一下，不过没什么影响。个人喜好的问题。.冷丙酮固定，需要多一步tritonX100处理，以便于增加细胞的通透性。.细胞爬片的免疫组化是否需要抗原修复，如果需要应该用什么方法？另外免疫组化中应该注意什么问题？是否时间较长就容易出阳性结果？谢谢Dongwp管理员：用多聚甲醛4度固定，一般不需修复，根据需检测的抗原和抗原所处 的部位而定，4度过夜的一抗孵育条件较易出阳性结果。Victoh版主：的确不需要。xiaodonglv0828;不需要抗原修复，抗原修复主要针对的是石蜡切片因固定剂、石蜡的制作过程对抗原的交联或封闭作用。.要用Triton X-100做细胞穿孔的。.抗原

14、修复主要针对的是石蜡切片因固定剂、石蜡的制作过程对抗原的交联或封闭作用。单 细胞所用的固定剂和石蜡不一样，过程不是很繁琐，固定时间也短，不用修复，但要充分灭活。.很多文献都介绍用冷丙酮或乙醇固定。我比较了两者的效果，觉得用80%的冷乙醇固定10分钟，固定效果比较满意。用纯丙酮或乙醇固定，细胞收缩比较明显。.直接把培养板取出，吸出培养基，然后用预热的PBS洗三次(5min*3),就用4%的多聚甲醛固定做免疫组化，其余的步骤就没什么特殊了！.加不加Triton是和您要染细胞的抗原分布和用途有关：Triton的作用是在细胞膜上打孔，以便抗体进入！a)如果要染抗原分布在细胞膜上面，那么就不能加Trit

15、on;b)但是如果抗原分布在胞浆或核内，那加入 Triton就显得比较重要(虽然细胞在固定 后的通透性较活细胞大，但是还不至于让任何东西都过去！)；c)另外作电镜日一定不加 Triton。.DAB显色完，不用酒精脱水，直接封片么？细胞还可以，但是组织切片的最好还是酒精脱水。这样的观察结果会好一些！.聚甲醛固定后，tritonx 100通透，也可以不需要抗原修复的，正如 xdb86所言在于你检 测的抗原的要求，先不用修复，出不来再试一试！.整理过程中一些细胞爬片的小细节技巧爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞 不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。这一步

16、至关重要，否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。PBS对玻片是冲洗还是浸泡，我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4C的好，有人认为37 C的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4 C冰箱中。我发现直接用4。C的溶液会造成细胞冷休克，从片上脱落。(4)染色滴加抗体时，为了节省抗体，可以先把抗体滴加在干净的载波片上，然后玻 片的细胞面朝向抗体倒扣，同时注意防止气泡和玻片的正反。一般 24毫米

17、的玻片只需要30-50微升抗体。当然如果操作不熟练，抗体又足够，那就直接在玻片的细胞面上加抗体吧。.爬片的前期处理(1)取干净的盖玻片(剪去一角，以作为正反的标记)若干，用洗衣粉轻轻擦洗后烤干(注意轻柔，不要留下明显痕迹，方便以后观察细胞) 。(2)硫酸重铭酸钾过夜。(3)取出盖玻片后，用自来水反复冲洗20遍。(4)用一蒸水漂洗10分钟，三蒸水冲洗 3遍。(5)晾干后泡纯酒精过夜(主要是脱脂，也可用95%酒精)，用镣子夹出(不能用手去接触玻片，否则应重新泡酒精脱脂)，蒸储水清洗后自然晾干(烤干容易使玻片留下水迹， 而晾干的则清新干净)。(6)高温高压消毒。(7)再根据实验要求考虑是否包被多聚赖

18、氨酸。个人的最后总结： 细胞爬片做组化不需要抗原修复，但是需要用tritonx 100通透，如果不放心的话，先不用修复，出不来结果的时候再试一试修复！ 细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗 衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌， 然后再烤箱中大约 8小时烤干备用。爬片可以在培养皿 六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。 一为节约经费（培养皿 可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把 镣子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液

19、（注意：这一点很重要，关 系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5% CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4%多聚甲醛中固定 15分钟，然后 再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注 意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底 干了之后才能做后续实验，要不然

20、玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在-20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。2.4%多聚甲醛固定10min（固定细胞器用预冷的 70%甲醇+30%丙酮）；3.PBS 漂洗 5min；4.0.5% Triton穿孔15min（丙酮固定法不用透化处理 ）；.PBS漂洗2次，每次5min；.1%BSA 封闭 30min ;.加入1%BSA稀释的一抗，于 37c杂交2h;.PBS漂洗2次，每次5min；.加入1%BSA稀释的二抗，于 37c杂交1h；.PBS漂洗2次，每次5min；.5ug/ml DAPI 染色 2min；.抗淬灭封片剂封片。抗淬灭封片剂：5% DA

21、BCO （w/v）50mM Tris（pH8.0）90%甘油.细胞爬片可以用含叠氮钠 PBS液保存.但不知道具体浓度，请告知.多谢！加在液体中作为防腐剂的叠氮钠浓度一般为0.04-0.08%。但是我建议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必要的问题！. louischen wrote:但我的细胞爬片经过 4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了 20度， 还能用于免疫组化吗？！应该没有问题，但是还是现作先染好些，以防抗原的丢失. mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定，固定液需加 DEPC水。其它建议用甲醇固定。一 20 度保存.如果是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保

22、存两周没问题。时间再长就没试过了。.丙酮中固定5-10分钟，然后风干，放置4度保存过夜应该是没有问题。不要固定过夜，蛋白质固定过度，会影响抗原的暴露， 影响免疫组化结果。 如果是胞浆或胞核抗原出现假阴 性结果，可考虑应用 0.5%的triton-100孵育30分钟，渗透细胞膜。如果玻片没有经过特殊 处理，不要用其他抗原修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会.丙酮固定后，PBS洗涤3次，即可保存至 4度冰箱备用。. （1）细胞爬片先用 TBS洗3次，每次5分钟4%多聚甲醛固定，室温，20分钟70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水，通风橱内干燥，-80度保存。2周没有问题的，我

23、保存过2个月都有信号，不过还是保存时间短一点的好.我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后，就放在室温中，因为是要拍电镜，但是学校电镜坏了，呵呵，所以放了一个月后去拍，还是很好.细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮等固定，用PBS冲洗后，晾干，放在-20度保存一个月没有问题的。.细胞爬片，有机溶剂如 4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，轻轻摇动玻片或培养皿等，静 置2min左右，弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70C长期保存。解冻时要小心抗原破坏，应先将标本转移于干冰预冷的固定液，然后再将混合液转移至室温下，固定液到达室温时取出标本，再用 PBS冲洗，在做以后的步骤。.我也做

24、过细胞爬片的组化染色，不过没有遇到类似的问题。细胞培养好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛4度固定15分钟，自然风干。室温保存几周内都可以用的。我想这 可能与抗原的类型有关，有的对氧化等损伤比较敏感，有的差一些。最好避光保存在4度,同时尽量隔绝空气。免疫荧光与普通DAB显色差别只再二抗的标记，样品的保存应该是没有多大差别的。.细胞爬片丙酮固定后-20度保存，现在要再做免疫荧光，将保存的爬片拿出37度复温然后常规操作就可以了.爬片做免疫组化的优势在于抗原新鲜，细胞形态保存较好。若爬片需长期保存并出现你这样的问题，原因可能是：1）试验步骤有误，建议重复并加阳性对照片。2）加一抗前处理同石蜡切片，可

25、进行抗原修复，如胰酶消化或热修复。3）因为抗原抗体反应在液相中进行，故对已极度干燥的爬片充分水化很重要。建议试验前用PBS浸泡过夜。. 4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用无水酒精的，固定好后放 -20度，2-3个月是 没有问题的。.对于一般的细胞免疫组化，我的做法是：细胞爬片用冰的纯丙酮固定 20MIN ,再在通风柜将丙酮吹干，一-20度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖，穿透性很强，保存抗原 的免疫活性好。所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固定剂。当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。如：1.多聚甲醛（常用4%）:可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特

26、别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇（CD）、主要组织相容性抗原等.乙醇。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆 内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻， 固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度.甲醛（福尔马林）应用最广 优点：形态结构保存好，且穿透性强，缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液 pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。. 4度是不能保存这么长时间（1个月）的，如果抗原已被分解，再修复也没用！.弃去固定液，不用 PBS洗而是采用空气干

27、燥，干燥后的标本可于-70 C长期保存。.爬片置于37度PBS中洗三次，每次 3到5秒钟，然后在4%多聚甲醛中固定15分钟, 然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程 中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在-20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。.固定后放点PBS,然后放在4度冰箱中保存，我最长保存两个月的，然后再做免疫组化， 应该没有太大的问题的。.固定后4度可以存放一

28、周，-20度存放半年，我现在也要做这个，实验室老师教的。.四度放1周应该没问题的，你最好放在2。度，我在2。度放一个月都还出结果的.很多人作的片子很多，不可能一次作完，一个月没问题.最佳的固定及保存方法：(1)中性缓冲福尔马林(不必调pH):福尔马林(40%甲醛，用时加入过量碱式MgCO3中和)10.0mlNa2HPO4.12H2o 1.9653gNaH2PO4.2H2O 0.5460g加0.85 %NaCl溶液溶解，定容至 100ml。(2)细胞固定：待细胞接近长成单层时，用镣子取出盖玻片， 迅速于37CPBS中漂洗2次，每次3-5秒，以清除血清。(3)将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温

29、固定30min。(4)用镣子取出盖玻片，PBS漂洗2次，每次3-5秒，晾干保存于-20C备用。可长期保存，做实验时，取出片子，入PBS湿润后即可进行你的实验。可以用于做免疫细胞化学(H.E.)或免疫荧光。(本帖没有加分).细胞爬片固定以后要放在 -20度的冰箱.1个月内可以用. skywalkerzz wrote:过氧化氢处理这一步，用三蒸水稀释商品浓度为 30%的过氧化氢，然后室温下玻片放在其中浸泡10min,是不是过氧化氢导致细胞严重脱片？簌软爬片应该用甲醇/双氧水，你的细胞极可能是过氧化氢导致严重脱片.本人比较喜欢用4%得多聚甲醛，20分钟很好用的。保存的时候注意片子最好晾干，不 要挤压，防止粘片和碎裂。.细胞爬片固定好以后，如果要保存，我们的做法是倒掉固定液，PBS漂洗后干片保存在4度，最长半年没问题。. 1、用新鲜配制的预冷的 4%多聚甲醛缓冲液室温固定15 min , PBS (0.01 mol/l, pH7.4)洗涤3遍后是否就可以进行免疫细胞化学染