细胞学- 干细胞工程

1、一个胚胎干细胞第九章 干细胞工程 1999年12月，美国科学杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在人类基因组计划之前，名列十大科学进展首位。 它为人类的健康提供了新希望，由于在针对最具破坏性疾病的新疗法上,干细胞技术具有重要作用。一、什么是干细胞？1、概念 干细胞（Stem cell）即起源细胞。在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞。因此，干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。全能细胞囊胚囊胚内层细胞团多能干细胞原始胚胎细胞胎儿 人体发生过程： 受精 卵裂 受精

2、后72h 受精后5-7天精子+卵子 合子 卵裂球 桑椹胚 囊胚 滋养层胎盘及胎儿附属结构囊胚 内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。 内细胞群 中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层体表结构；神经系统它们是未分化的，但具有分化成各种特定细胞的能力；它们可无限地分裂产生大量后裔;其子细胞有两种命运，保持为干细胞或分化为特定细胞。2、干细胞的主要特征：胚胎干细胞全能干细胞多能干细胞单能干细胞按分化潜能按发育状态胚胎干细胞成体干细胞3、干细胞的分类全能干细胞： （Totipotent stem cell）具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞（ES细胞）多能干细胞：（plur

3、ipotent stem cell）具有分化出多种细胞组织的潜能。如造血干细胞、神经干细胞。单能干细胞：（multipotent stem cell）只能向一种或两种密切相关的细胞类型分化。如上皮组织基底层的干细胞，肌肉中的成肌细胞。胚胎干细胞ES细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。在未来几年，ES细胞移植和其它先进生物技术的联合应用很可能在移植医学领域引发革命性进步。成体干细胞 成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定

4、条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。 二、 胚胎干细胞黄禹锡干细胞造假案 黄禹锡黄禹锡被誉为韩国“克隆之父”，民族英雄。韩国评选的首位“最高科学家”，他的名字出现在中小学教材中但这位“民族英雄”先是被指控违背研究伦理，紧接着又被指控欺世盗名、伪造研究成果。从来没有一个科学家被本民族寄予如此大的期望，因此，当这个科学家倒下的时候，这个国家的人惊呆了主要问题实验室假造论文,年发表的论文中所使用干细胞照片系造假，以及黄本人是否参与造假。调换干细胞样本, 2005年在科学发表的论文中的干细胞其实不存在。11枚所谓的干细

5、胞中，已经有9枚证实是伪造的，另外2枚的真实性还有待验证” 试验用卵子来源:强迫其手下女研究人员提供卵子用于实验. 科研经费使用情况: 私吞22亿韩元科研经费.衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；永生化(immortal)；能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；能参与胎儿所有组织的发育过程；1 胚胎干细胞的性质2.人类干细胞的来源成人细胞或脐血/胎儿组织(专能/多能)。人工流产后的人类胎儿生殖组织(全能)。用捐赠者的配子通过体外授精创造的人类胚胎(全能)。通过体细胞核转移技术(克隆技术)产生的人类胚胎(全能)。以上都必须获得当事人的知情同意。 3 胚胎干

6、细胞系的建立过程胚胎干细胞的培养4 培养条件：特殊的培养液：胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；-巯基乙醇。 以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。(3) 必须加入LIF(白血病抑制因子)，抑制细胞分化。干细胞的分化干细胞培养过程5 干细胞诱导分化的常用方法（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质， 如DMSO和RA等 ( 二甲亚砜和维甲酸中性粒细胞的诱导分化剂 )（2）将ES细胞与特定的细胞共培养 （3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细 胞内 胚胎干细胞的诱导分化： 胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞造血细胞 RA胚胎干细胞神经细胞 DMSO胚胎干细胞肌肉细胞 TGF-B1, b

7、FGF胚胎干细胞血管和内皮细胞 RA+胰岛素+T3胚胎干细胞脂肪细胞 BMP-2, BMP-4胚胎干细胞软骨细胞 地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞骨细胞 基因转染胚胎干细胞胰岛素分泌细胞粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），人碱性成纤维生长因子(bFGF) ，小鼠转化生长因子b1 (mouse TGFb1 )形态构建蛋白2，4（BMP-2，BMP-4）6 胚胎干细胞的鉴别 胚胎干细胞具有以下特点：(1) 细胞内碱性磷酸酶活性高(2) 端粒酶活性高(3)细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81(4)能分化成三个胚层的细胞，(5)将胚胎干细胞植

8、入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤(6) 可诱导分化为各种成体干细胞细胞表面抗原:糖脂抗原 SSEA-3、SSEA-4 肿瘤相关抗原(tumor-related antigen,TRA)TRA-1-60，TRA-1-8 胚胎干细胞7 胚胎干细胞的特性鉴定干细胞的常用方法：（1）细胞形态与结构（2）细胞功能（3）细胞表面的特殊标志 （4）细胞内特异基因的表达Culturing Hematopoietic Stem Cell 8 来源于干细胞的组织可能用于治疗的疾病 细胞类型 治疗的疾病神经细胞 中风、帕金森氏病、老年痴呆症、 脊髓损伤、多发性硬化病心肌细胞 心脏病发作、充血性心脏病产生胰岛素的细胞

9、糖尿病软骨细胞 骨性关节炎血细胞 癌症、免疫缺乏症、遗传学血液 病、白血病肝细胞肝炎、肝硬化皮肤细胞烧伤骨细胞骨质疏松症视网(眼)细胞黄斑症骨骼肌细胞 肌肉萎缩症帕金森氏病帕金森氏病又称震颤麻痹，是中老年人最常见的中枢神经系统变性疾病。震颤是指头及四肢颤动、振摇，麻痹是指肢体某一部分或全部肢体不能自主运动。 中国首例神经干细胞移植治疗帕金森氏病获成功中国第一例神经干细胞移植治疗帕金森氏病手术近日在石家庄市医科院获得成功。岁的印尼籍华人谢喜云，患帕金森氏病十几年，痛苦不堪 石家庄市医科院将专门培养的神经干细胞准确植入颅内，依赖干细胞的再生和增殖能力修补病患脑组织。 神经干细胞是从早期废弃胚胎中获

10、取，经培养、克隆扩增后应用于临床的。 法首创干细胞移植治疗烧伤法国格瑞诺布军医研究中心成功利用干细胞移植，治愈一名因放射线照射，皮肤遭严重破坏的病人。根据世界报报道，格瑞诺布军医研究中心在一个半月前，治疗一名遭放射线烧坏右手皮肤的伤患，这名伤患受伤程度可导致截肢。为避免截肢，医师自伤患身上取出脊髓，分离出其中干细胞，在实验室中转化为皮肤细胞并进行增生，然后移植到伤患手上。伤患恢复情形良好，手部知觉已完全恢复，也不再疼痛。谁从干细胞研究中受益？下面的疾病一半以上没有有效的治疗办法 疾病 发病率帕金森氏病 1/500老年痴呆病 65岁以上1/20糖尿病 3/100心脏病 55岁以上1/3肝病 1/

11、12癌症 74岁以上1/4骨质疏松症 60岁以上1/3成体干细胞研究是干细胞研究中最激动人心的部分。它可以有效地防止组织排斥，可以避免伦理学、法律系方面的争论。成体干细胞是否具有胚胎干细胞那样的分化潜力？ 大量的动物实验证明了成体干细胞具有很强的分化能力。9 成年个体的干细胞研究从成年小白鼠未发育的脑干细胞转变为肌肉细胞Angelo Vescovi 和 Giulio Cossu, 在 the Institute for Stem Cell Research in Milan 2000-9-20他们也用成年人志愿者的神经干细胞实现了同样的工作自身干细胞治疗肝病2005年10月8日出版的新科学家杂

12、志报道，英国科学家利用肝病患者自身骨髓干细胞对其进行治疗，取得了明显效果。伦敦大学帝国理工学院的一个小组首先向肝病患者注射粒细胞集落刺激因子（GCSF），诱使其骨髓产生更多的干细胞。随后，再对患者骨髓细胞进行筛选，挑选出具有表面蛋白质CD34的细胞，该蛋白质是干细胞的标志。最后，将这些干细胞浓缩并注射到患者的门静脉和肝动脉中，这两条血管直接向肝脏输送血液.但这些细胞很快便进入了患者肝脏的受损部位，并对其进行了修复。在连续治疗两个月后，5名患者中的3名肝功能和身体素质都有了明显的改善.10 胚胎是“人”吗？胚胎是人(person)？胚胎是生命？胚胎是人类生物学生命(human biologica

13、l life)，但尚未成为人类人格生命(human personal life)。胚胎具有一定价值，应得到一定的尊重(due respect, 如尸体), 没有充分的理由不能操纵和毁掉。毁掉胚胎要一定程序去做。胚胎对胚胎应有的尊重和应有的处理程序应有的尊重指适当的尊重：在完全尊重（人）与不必尊重（如一块孤立的石头）之间：非人动物、胎儿、胚胎、尸体等。人类胚胎用作研究必须是体外的，不能超过14天；不用人类胚胎，重要研究的目的就不可能达到；不是商品，不能买卖；科学家应采取必要的行动纪念那些胚胎的贡献；必要的程序是指专门的埋葬或活化，也应有简单庄严的仪式。动物与人的嵌合问题人的配子与动物的配子制造嵌

14、合体。后果会如何？出现一个“人头马”怎么办？广州某大学教授用一名7岁的男孩的皮肤体细胞核植入去核兔卵母细胞内，克隆出100多个胚胎。目的是什么？因为人卵难得？为什么不用流产胎儿卵或女尸的卵？这种嵌合体不是人类胚胎，获得的干细胞不是人类干细胞.三、 造血干细胞应用造血干细胞是体内各种血细胞(白细胞红细胞血小板)的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。造血干细胞移植是骨髓移植、外周血造血干细胞移植和脐带血移植的通称。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病最有效方法。骨髓含有大量的造血干细胞, 造血干细胞来源于红骨髓。骨髓移植是指將健康的骨髓输入受体，取代原本有病变骨髓，使其发挥正常的骨髓功能。

15、骨髓移植是治疗血液疾病的最早的方法，1968年第一次骨髓移植成功。如有适当的供髓者，骨髓移植已有百分之八十至九十的长期存活率。1 骨髓移植:骨髓移植缺点：全身麻醉抽骨髓抽取量：約抽1020毫升/公斤的骨髓。 骨 髓 采 集骨 髓 采 集临床造血干细胞移植的过程 全身钴60照的放射剂量监测全身钴60照射（ TBI） 应用荧光显微镜进行白血病免疫分型骨髓细胞学分析无菌层流病房2 外周血造血干细胞移植:造血干细胞细胞由骨髓大量生成，其中少量的干细胞被释放到血液中，这就是外周血干细胞(PBSC）.优点:1.采集安全简便, 避免骨髓穿刺痛苦。2.造血及免疫功能恢复快3.受肿瘤细胞污染机会减少。外周血造血

16、于细胞移植在临床应用时存在的问题：外周血的造血干细胞量极少，不能满足移植的需要， 收集的外周血干细胞可能混杂有肿瘤细胞；移植中存在大量T细胞，可能诱发严重移植抗宿主病 (GVHD) ；常用的是造血干细胞分离机，机型是FewnalCS3000(或CS3000Plus)。一般情况下行大静脉穿刺即可。采集成人时的血流速度为5060m1min，每次分离46循环(约34h)，分离血液的总容积9L，依据情况连续或隔日采集。造血干细胞移植大约需采集捐献者克的造血干细胞, 因此要对捐献者使用造血生长因子(HGF) ，加速骨髓造血干细胞的生成并释放到外周血中，可使外周血造血干细胞增加倍倍 .外周血干细胞(PBS

17、C)的采集方法血细胞分离机脐带血可以长期保存备用。一个胎盘和脐带的80多克血中所含的干细胞足以重建一个白血病患者的血液和免疫系统。认识到脐带血移植的优点，国内外众多医疗机构己建立了脐带血库。back3 脐带血移植:3造血干细胞配型捐赠者的人类白血球抗原(HLA)必须和病患相合者（万分之一 ）。不要求血型一致，接受骨髓移植后受者的红细胞血型会变为供者红细胞血型。 亲属：以兄弟姐妹(有1/4的机会HLA相合)造血干细胞移植的应用 。台湾同胞骨髓成功移植于徐州两名患者体内白血病患者能找到和自己完全相同的高分辨基因配型的概率只有万分之一！跨越海峡的骨髓移植是一项高难度、高风险的手术，供者的骨髓从抽取到

18、输入必须在24小时内完成。从台湾的花莲到江苏的徐州路途遥远，稍有闪失就会前功尽弃。在台湾当地慈济骨髓库近30万份的资料 我国内地首例向台湾同胞提供造血干细胞2006年05月24日 ，哈尔滨32岁的小伙子闫善义手捧鲜花，与省红十字会、省造血干细胞管理中心的领导和工作人员以及亲友依依惜别，乘机前往北京采集造血干细胞，实现捐髓救人的愿望。无偿献血新概念 1 机采成分血？目前国内以捐献机采血小板最为普遍。从一只手臂入针通过相联接的经过消毒、一次性使用的管道流入血液分离机，分离出所需要的某一种成分（血小板），同时从另一手将其它血液成分输还给献血者。全过程因人而异约需小时。捐献机采血小板的基本条件 1、年龄：18-55周岁；2、体重50公斤以上；3、经体检各项检查