交替氧化酶与丙酮酸的相互作用

1、从产热斑叶阿若母中纯化的交替氧化酶与丙酮酸的相互作用关键词：交替氧化酶，作用机制，丙酮酸调节，酶的稳定性，二铁羧酸盐蛋白，产热作用 摘要：植物离体线粒体的交替氧化酶活性被羧酸调控，但是反应和调控机制还不清楚。我们 的研究表明，从产热斑叶阿若母肉穗花序中纯化的AOX蛋白对丙酮酸和乙醛酸敏感，对琥 珀酸不敏感。缺乏丙酮酸时，AOX迅速的不可逆的失活，不管杜氢酸是否开始氧化，AOX 对杜氢酸不敏感。数据表明，丙酮酸能稳定AOX的活性构象，以单独地减少底物和产物的 方式增加活性蛋白的数量，这丙酮酸对酶的表观最大速率的独特作用是一致的。1、介绍AOX是非电子激发的醍氧化酶，它位于高等植物、真菌和某些寄生

2、虫(包括布氏锥虫 和隐抱子虫)线粒体中。虽说两个独立的电磁共振研究证明AOX的活性中心由双核的铁中 心组成，AOX的结构和机制已经被全部建立。近期具有说服力的傅里叶变换红外光谱学的 证据坚定地把AOX归入了膜结合二铁羧酸蛋白这类蛋白中。一项重要的发现表明，从植物中分离得到的线粒体表明某些羧酸强烈激发AOX的活性。 在非产热物种的线粒体中，例如从大豆子叶和烟草叶中提取的线粒体AOX的活性完全依赖 丙酮酸的参与。乙醛酸和其他的a-酮酸能代替丙酮酸，同时，琥珀酸可以代替丙酮酸激活 土豆和产热的莲中的AOX。从产热的斑叶阿若母肉穗花序中分离的不仅表现出丙酮酸可促 进得活性，还在产热增加过程中表现出丙酮

3、酸不敏感的基本AOX的活性。据推测，AOX和丙酮酸分子间的相互作用出现在邻近的两个关键的Cys形成含硫半缩 醛时，这两个关键的Cys在许多丙酮酸敏感的AOX酶中都是保守的。人们推测，这个含硫 半缩醛引起点位诱导的构象变化，这种构象变化对于激活AOX是必要的。如果用Ser替代 了 Cys，那么这种同功酶将不会被丙酮酸激活而被琥珀酸激活。最重要的是，我们目前对于 斑龙芋AOX的研究暗示，一系列保守序列元件很可能参与丙酮酸的结合作用。尽管，AOX和丙酮酸分子间的相互作用的结构研究有一定的进展，但是，具体丙酮酸 激活AOX的机制还不清楚。人们观察到，只有线粒体泛醍库高度诱导的情况下丙酮酸才激 活AOX

4、，因此断言，丙酮酸增强了 AOX与其还原底物的相对亲和力。自从张等发现用丙 酮酸纯化AOX，人们一直争论丙酮酸对于AOX的最大活性具有专一性。为了把这两种观 察结果解释清楚Hoefnagel和Wiskich假想了一个模型，模型中丙酮酸通过自身的氧化泛醍 产物保护酶免受失活。我们认为用实验验证这条假说非常重要。在这篇论文中我们阐明了 AOX调控，我们用的是从斑叶阿若母肉穗花序中提取的活性 高、稳定性好的AOX。我们研究表明，纯化的产热的AOX的杜氢醍(DQH2)的氧化活性对 于丙酮酸和乙醛酸敏感，而对琥珀酸不敏感。这种敏感性是由于缺乏丙酮酸引起的不可逆的 酶失活。这种失活不需要DQH2氧化，而且

5、对DQ的形成不敏感。因此，我们的研究结果 表明，丙酮酸通过单向的减少底物和产物来稳定AOX的活性，同时，也支持了a-酮酸对于 AOX的表观Vmax具有独特的影响的观点。2、材料和方法2.1化学药品N,N-Bis deoxycholamide 是从 ICN Pharmaceuticals 购买的，其他的药品都由 Sigma 供应。 2.2AOX纯化如上所述，AOX是从产热的阿若母线粒体中提取纯化的。简单来讲，AOX是从产热的 阿若母肉穗花序中提取的，加入2 mM的丙酮酸，-20 C冷冻，-70 C保存。纯化时，经证 实，线粒体的活性在保存过程中全部保留。通过冻融渗透震动线粒体得到亚线粒体粒子 (

6、SMPs)，然后根据上述方法提纯AOX。AOX从deoxyBIGCHAP中溶解，然后用DEAE sepharose-based色谱分离提纯。AOX用0.5% w/v deoxyBIGCHAP洗脱。值得注意的是，纯 化介质中都含有丙酮酸和DTT。将AOX样品分装储存于-80 C备用。样品至少可以保存活 性一年，表现为对没食子酸辛酯非常敏感而对粘噻唑不敏感。2.3实验AOX的活性用色谱级的氧吸收测定，或者用分光光度计同时测定氧化、还原DQ的浓 度，2-甲基氨基乙磺酸-氢氧化钠PH6.8。所有实验都在D介质中有机酸中或缺乏有机酸的 条件下完成的。用连二亚硫酸钠还原DQ制备DQH2。DQH2固体要室温

7、避光保存，使用时 用酸化乙醇重悬。储存浓度要用分光光度计测定以下消光系数：DQ酒精溶液在259 nm为 17.8 /(mM*cm)，DQH2 水溶液在 283 nm 为 2.15/(mM*cm)0 在 DQH2 氧化实验中，没有用 DTT作为标准物，防止DQ被DTT还原。所有实验中AOX的共价二聚体的状态没有改变。 氧消耗是用Clark型氧电极在室温下测得的。数据用装有Chart 3.6s版软件的PowerLab/4SP 系统进行数字化记录。AOX被加入到1 ml的D介质中，随后有机酸从100倍的储存中加入 25 mM Tes-NaOH溶解 PH6.8，加入 250gM DQH2 后反应开始。

8、对于光谱测量实验，时间决定的吸光度值用Cary 400 Scan UV Visible吸光光度计在250 和290 nm处测得，像先前描述的一样，实验进展曲线是准初始速率的数倍。250nm DQ的 消灭系数 7.10 和 0.534 /(mM*cm)，290nm DQH2 的消灭系数是 0.334 和 1.62 /(mM*cm)。所 有实验都是在能用于磁力搅拌的半微量比色皿中，在20 C恒温箱中进行的。如图例所示， AOX的活性是在丙酮酸参与或者缺乏的情况下在700 pl的介质D中测量的。在添加AOX 或250 pM DQH2后反应开始。3、结果与讨论3.1纯化AOX的活性依赖各种有机酸首先，

9、我们根据各种孵育条件下AOX依赖的耗氧量来研究纯化的AOX对于丙酮酸和 其他有机酸的依赖性。我们或其他的科学家之前的研究表明，纯化的AOX需要结合去污剂 (EDT-20)和丙酮酸才能保持完整的活性，二者缺一就会降低AOX的活性。Fig. 1A呈现出的 结果证实了这一见解，在EDT-20的参与下，丙酮酸或乙醛酸是AOX介导的耗氧速率约提 高8倍。然而，琥珀酸对其没有明显的作用。乙醛酸促进AOX的活性，不管丙酮酸和琥珀 酸参与与否，往往会比丙酮酸单独介导的活性要高一点。这表明，AOX对乙醛酸的敏感性 比丙酮酸更高。琥珀酸不会显著影响丙酮酸介导的AOX的活性。特别有趣的是，用琥珀酸 预孵化30s会阻

10、止丙酮酸和乙醛酸介导的AOX的活性。这个发现表明，AOX在丙酮酸或乙 醛酸参与下是不稳定的；抑或表明，琥珀酸阻止了蛋白与丙酮酸和乙醛酸的相互作用。3.2缺乏丙酮酸情况下，AOX不可逆失活，不考虑酶变化为了观察丙酮酸对纯化AOX的醍氧化活性的影响，我们下一步利用先前开发的分光光 度计实验法同时测量DQH2的氧化和DQ的生成Fig. 2A显示在丙酮酸参与或缺乏情况下， 时间决定的AOX对于DQH2的氧化。当加入底物反应开始时，分光光度计测定的初始AOX 活性都非常相似，再加上或减去丙酮酸的作用。缺乏丙酮酸是，随着底物的变化，AOX的 活性会显著的丧失DTT不影响丙酮酸的作用表明了，AOX失活不是因

11、为蛋白氧化造成的。 总之，这些观察结果表明，丙酮酸仍旧结合在AOX上，不管是纯化时，还是在丙酮酸被洗 脱失活时。接下来，我们在没有还原底物的情况下，孵育AOX土丙酮酸一段时间，来探索酶失活 的可能的原因。Fig. 2B的数据表明，孵育后AOX的活性下降明显，不管丙酮酸参与与否。 然而，在没有丙酮酸的情况下孵育90s后，AOX的活性下降到对照的10%，而在丙酮酸参 与下从来没有降到60%以下。Western分析结果表明，孵育过程中AOX的还原状态并没有 改变。Fig. 2B中显示的发现表明，丙酮酸对于未变性酶起稳定性作用。这个观察结果似乎 与先前的预期有分歧，之前，我们企图通过脱盐作用出去部分提

12、纯AOX中的丙酮酸，之后 在厌氧性环境中用乳酸脱氢酶孵育，结果AOX的活性仅仅降低了大约40%。但是，由于准 备和孵化阶段NADH-Q氧化还原酶对于NADH的活性，或者准备工作时的不同的液态环境， 这种发现可能被维持酶结合醍的还原态混淆。由于在提纯AOX时需要丙酮酸而推断存在非 结构依赖性AOX失活现象。不考虑酶自身结构的变化，酶活的半衰期大约为30秒。尽管 在同浓度的乙醛酸和丙酮酸中，AOX对于DQH2的氧化率，前者比后者高30-40%，潜在的 反应了不同的亲和力和包括a-酮酸在内的氨基酸残基的微妙的变化，但是，用乙醛酸代替丙 酮酸会出现同样的现象。因此，似乎乙醛酸和丙酮酸与AOX的作用相似

13、，目前，我们的数 据不能排除这些a-酮酸再作用机制上有微小的差别。另一方面，加入底物之前，用10mM 的琥珀酸孵育与用不加任何羧酸的缓冲液孵育相比，AOX的失活程度相同。这表明，琥珀 酸在保护酶免受失活方面没有任何作用。可以确定的是，在丙酮酸敏感物种中分离得到的线粒体中，丙酮酸对AOX的激活作用 是可逆的。但是，在丙酮酸加入AOX中预孵化30s稳定其活性之后，除去纯化AOX中的 丙酮酸，AOX就会发生不可逆的失活，而且不能恢复。因此，AOX的活性完全依赖于丙酮 酸（或其他a-酮酸）。一个非常有趣的重大发现是，产热阿若母线粒体和SMPs中既有丙酮 酸依赖的AOX也有非丙酮酸依赖的AOX。这些差异

14、可能是由于纯化样品中缺乏磷脂造成 的，这暗示AOX在其自身的膜环境中是稳定的。3.3AOX对于丙酮酸浓度的依赖性AOX初始速率对丙酮酸浓度依赖性的检测是不确定的，因为人们推断丙酮酸结合酶之 后然后进行纯化，并且当移除丙酮酸之后，酶发生不可逆的失活AOX对于丙酮酸的相对 亲和力通过以下方法估测：用不同浓度丙酮酸孵育酶2min，加入DQH2,测定AOX的活性。 通过这种方法得出，使 AOX活性下降到最大活性一半（K1/2）的丙酮酸的浓度至少为 0.5-1mM，不受琥珀酸的影响。这个K1/2比从大豆和卷心菜亚线粒体颗粒中分离的AOX的 K1/2高，可能又一次反应了纯化蛋白的环境不同。但是，值得注意的

15、是，我们的实验结果 对DQH2的浓度没有依赖性，这表明，丙酮酸不影响AOX与还原底物和产物的相互作用。 3.4丙酮酸稳定纯化AOX的活性构象，不依赖醍产物丙酮酸缺乏而导致AOX失活，这个现象有两种解释：（1）丙酮酸释放引起不稳定的构 象变化，二次失活（2）产物抑制低浓度的DQ。Fig. 3的分光光度计测定数据区别了这两种 解释。改变实验中AOX蛋白量不影响时间依赖的酶失活。这个观察指出，产物抑制是AOX 失活的一个不大可行的解释，当蛋白质数量增多时，人们希望加快DQ积累，因此加快了 AOX失活速率。实际上，酶活的半衰期与酶量无关。Fig. 3C是Selwyn用原始的方法绘制 的酶的数量和反应时

16、间关于DQ积累曲线，呈现了同样的蛋白依赖数据。在丙酮酸的参与下， 这个Selwyn曲线关于不同AOX数量的测定表明，酶的活力与数量成正比，在实验过程中， 没有检测到酶失活。这个曲线是线性的，直到大概100gM的DQ才出现产物抑制AOX活 性。另一方面，没有丙酮酸参与的情况下，曲线不重叠，在不同的0。浓度下，曲线偏离线 性关系，表明实验过程中酶失活。总之，Fig. 3中的数据说明丙酮酸维持AOX的活性构象， 不依赖DQ。4、结论人们提出了多种丙酮酸与AOX的作用机制，包括：丙酮酸因还原底物或产物与AOX 结合，最大AOX活性和氧气进入活性位点。有趣的是，在这个方面，AOX的末端Cys突 变成Ala会提高aox对氧气的亲和力。我们和其他研究人员之前争论，丙酮酸结合到Cys 会促进AOX构象变化，主要影响其对氧气的亲和力。这种构象变化可能是纯化AOX保持 活性所必须的。之前，我们发现了新的初始序列元件，它们可能是Cys之外影响AOX活性的因素。最 近发现，从产热莲线粒体中分离的AOX对丙酮酸和乙醛酸不敏感，相反，可以被琥珀酸激 活。对莲的两个序列分析发现，它和其它对琥珀酸敏感的AOX相似，Cys1被Ser取代。但是，值得注意的是，这种莲亚型在3区含有Q/ENV调控基元。3区是我们之前假定的对于 丙酮酸敏感的几段序列之一。人们需要进一步研究来建