抗生素的活性

1、抗生素的活性及其测定 定义抗生素对微生物(细菌、真菌及原虫等)抑制的能力称为抗生素的活性，并以此进行测定。生长的概念，当用于宏观生物时较为熟知，通常以单位时间生长体积的增加来表示。 定义对于微观生物，必须予以进一步明确。在这种情况下，生长可以在两种水平上加以区别，即群体生长和单个细胞生长。群体生长是指单位时间里微生物总数的增加，即微生物群体密度的增加。单细胞生长是指“个细胞产生二个子细胞时，细胞材料的合成。细胞生长的结果导致微生物群体的生长。定义通常，抗生素活性的定义是指抑制微生物群体生长的能力。活性的测定以直接进行单位体积中微生物总数的计数，或者测定培养物中与群体密度有关的某些参数，如光散射

2、性质。定义抗生素对细菌群体生长的抑制可能是可逆的或不可逆的作用。在可逆作用情况下，当抗生素不存在时，大部分细菌开始生长，抗生素对细菌的作用称为抑菌作用；在不可逆作用情况下，只有少数细胞或没有细胞存活，抗生素的这种作用称为杀菌作用。 活性测定 抑菌活性抗生素活性的一种定量测定方法，是测定抗生素完全抑制某种细菌生长的最低浓度，称为最低(最小)抑菌浓度(MIC)。下面描述的测定抗生素抗细菌活性的技术基本上也适用于酵母、真菌和某些原虫的活性。在液体培养基中测定最低抑菌浓度按传统方法测定MIC的方法如下：(1)准备一系列含有同样体积液体培养基的试管，被测试菌的接种量在每毫升103-106个细胞之间。现在

3、大都采用含有01m1体积培养基的微孔板。 (2)抗生素的浓度在每个试管中是递减的通常以对倍稀释法逐管稀释抗生素的浓度如在第一管中，抗生素的浓度为128 g ml，第二管为64g ml，第三管为32g ml，以此类推)。最后一管不加抗生素，作为细菌生长的阳性对照。在液体培养基中测定最低抑菌浓度在液体培养基中测定最低抑菌浓度 (3)培养物在所测试细菌的最适温度下培养一定时间，至少繁殖10-15代(通常过夜) (4)以混浊度用肉眼观察细菌在系列试管中的生长情况(实际上，培养物的混浊度至少在有107个细胞ml数量级时才能观察到)。在液体培养基中测定最低抑菌浓度在抗生素浓度足以抑制细菌生长时，试管保持透

4、明。从实验的角度而论，MIC是指“最后”一透明管中抗生素的浓度，即用肉眼没有观察到细菌生长的抗生素的最低浓度。在液体培养基中测定最低抑菌浓度显然，由于所用的方法是以抗生素对倍稀释及用肉眼观察细菌的生长，所得MIC不是一个十分准确的数值。在确定细菌生长时，只差管，MIC值则相差一倍。在液体培养基中测定最低抑菌浓度尽管如此，MIC对研究抗生素的生物学及临床应用，均为一个很有用的参数。然而应当明确，MIC值与试验条件及所用菌种有关，不同菌株对抗生素敏感性不同；因此, MIC值不尽相同。 在固体培养基中测定最低抑菌浓度从概念看，这种方法与用液体培养基进行测定是相似的。抗生素用含有琼脂的合适的培养基进行

5、系列稀释，然后倒入平皿在培养基表面接种欲测的菌种(1 l, 菌悬液中的细菌浓度为109细胞m1)。在固体培养基中测定最低抑菌浓度经过一定时间培养，以没有细菌生长或仅有少数单个分散的菌落形成的最低抗生素浓度作为最低抑菌浓度 这种方法的优点在于欲测细菌，以简化工作量累积曲线同种细菌的不同株对同一种抗生素显示不同的敏感性。要评价抗生素的的临床应用前景，必须测定它对每一种细菌诸多临床分离株的活性这点十分重要。累积曲线对于每种细菌的MIC的测定及其结果通常以下面几种形式表示：(1)活性范围，以较低的和较高的MIC值表示(2）MIC50表示抑制50的所测菌种的MIC值(3)MIC90表示抑制90所测菌种的

6、MIC值累积曲线所得结果，亦可用图形表示，以每种浓度抑制细菌株的百分数和相对应的抗生素浓度来制图。累积曲线的形状将反映菌株对抗生素敏感度的不同(图)。杀菌活性如果抗生素对细菌的抑制作用在较广浓度范围内是可逆的，则称为抑菌作用；当在稍高于MIC值浓度下的抑制作用是不可逆的菌作用。最低杀菌浓度(MBC) MBC测定方法如下：(1)依照在液体培养基中测定MIC所有的操作，所用于接种的细菌数应不小105。(2)经培养后，在没有可见生长的试管中取出一些液体，经适当稀释后，涂布于含有合适的固体培养基的平皿中。(3)平皿培养48小时后再观察生长，其菌落数被认为是相当于活菌数，MBC被认为是在乎皿上没有菌落生

7、长的最低抗生素浓度。实际上，MBC是以有菌落生长(CFU)的抗生素浓度来判断。该浓度下菌落生长数比原接种量减少1000倍(即01存活数)。杀菌曲线 不同抗生素浓度的杀菌速度是杀菌作用的一个重要参数，其测定方法如下；培养菌液，至少含有5105ml细菌数，加入一定量抗生素进行培养，在一定间隔时间内取样，经适当稀释，涂布于培养皿，经48小时培养后，菌落计数，乘以稀释度，即得到活菌数(一个菌落被认为相当个活菌数)。杀菌曲线以不同浓度抗生素和不同菌株进行同样操作，其结果通常以作图表示(图)。以形成菌落数的细胞数的对数与时间作图，所得曲线称为累积杀菌曲线。应用累积杀菌曲线来评价抗生素的杀菌作用，比用MBC

8、更接近实际情况。它与临床上服用抗生素后生物体内不同浓度抗生素的作用具有可比性。细菌对抗生素敏感性的测定为在临床上合理使用抗生素，经常需要了解引起感染的病原菌对哪些抗生素敏感，对哪些抗生累耐药对此，测定临床分离株对不同抗生素的MIC值是最可靠的。细菌对抗生素敏感性的测定然而，经典式的测定MIC的方法不太适用于大量菌株的测定。因而建立了一些较为简单而价廉的方法，其中最常用的是扩散法(又被称为干皿扩散法或琼脂扩散法)。在某些国家，尤其是英国，采用琼脂参入或临界浓度法，这里将简要介绍这些方法。1、 扩散法用标准浓度的待测抗生素溶液，浸泡滤纸片。在琼脂培养皿上，均匀涂布一层稀释的待测细菌悬液。将含抗生素

9、的滤纸片放在培养皿上，其中的抗生素扩散进入琼脂中，产生一个递减浓度梯度。培养皿保温放置1620小时，其中的微生物生长起来，密集的或半密集的菌落形成混浊的表层。许多实验室现用标准浓度的待测抗生素溶液，浸泡滤纸片。在琼脂培养皿上，均匀涂布一层稀释的待测细菌悬液。1、 扩散法在抗生素浓度高于MIC值的纸片周围，细菌不能生长，出现了一个透明的抑菌圈。这个透明圈的直径与微生物对抗生素的敏感性相关。1、 扩散法测量抑菌图直径，并与参考标准(中心点)进行比较。根据抑菌圈大小与参考标准的比较结果，可以将微生物的敏感性分为三类：敏感(抑制透明圈大于或等于参考标准)居间(抑制透明圈略小于参考标准)不敏感(抑制透明

10、圈明显小于参考标准)(即抗性)。为了更有效地使用扩散法，需要将其进行严格的标准化，KirbyBauer推荐的方法最为常见。扩散法的另变更是，同时培养待测菌株和同种微生物的标准菌株，以标淮菌株上面形成的抑菌圈作为参考标准，来确定待测菌的敏感性。 2、 临界浓度法的原理与固体培养基测定MIC方法测定细菌菌株对某个抗生素的敏感性时，把细菌接种在含有确定浓度抗生素的琼脂培养皿上，观察细菌是否生长。与前面的方法不同，临界浓度法的结论很明确，生长或不生长。 2、 临界浓度法的原理与固体培养基测定MIC方法即能形成菌落的菌株，就认为是有抗性，否则就是敏感, 而无法确定抗性或敏感的、也无可能将细菌划分为“居间

11、”的类别中。为了避免这一缺点，在测定时，可以另加一个抗生素浓度更高的培养皿。这样，可以对抗性的水平有一个了解，从而将那些在较低浓度抗生素培养皿上生长，而在较高浓度抗生素培养皿上不生长的菌株划分为“居间”。3、散布图及中心点的选定使用上述方法测定细菌对抗生素的敏感性时必须要先区分一定菌株对抗生素敏感还是抗性的浓度标准。般主要根据药理学及药代动力学等一系列参数确定这个浓度标准。其中最主要的是血液中的水平、清除率和血清蛋白结合情况。3、散布图及中心点的选定为了确定标准浓度(中心点)的临界抑菌圈直径、需要测定大量(100至200株)代表各种致病菌的菌株的MIC值。对于每一株，要用纸片法测定一定量抗生素

12、所产生的抑菌圈直径，然后绘出以MIC值的2为基数的对数作纵坐标和以抑圈圈直径作横坐标的散布团。3、散布图及中心点的选定经过均方处理，可以其出抑菌圈直径与MIC对数的直线关系方程式。从中可以获得中心点，即标准浓度的抑菌圈直径，还可以算出其他已测数值的波动值。4抗菌素谱抗菌谱是指某一种微生物对一组抗生素的敏感或抗性情况。通常是用前面介绍的任一种方法测定抗菌素谱。在使用扩散法时，在涂布有待测菌株的培养皿上，放置不同抗生素的标准滤纸片。需要提醒的是，透明圈的直径并不仅仅依赖于抗生素的活性，还与抗生素的扩散速率有关。如果不加思索地认为透明圈越大，抗生素的活性就越高将足错误的。在使用临界浓度方法时，可以利

13、用复合接种器在一个加有标准浓度抗生素的培养皿上，同时接种许多待测菌株。4抗菌素谱比较准确的方法是，在液体培养基中测定抗菌素谱。目前，常常利用部分或全部自动化的仪器，在微型系统中测定抗菌素谱。抗生素的相互作用 相互作用或干扰，是指两个抗微生物剂同时加入微生物培养物时，一个抗微生物剂对另一个抗微生物剂的作用的影响。抗生素的相互作用协同作用，是指联合作用时的抗微生物效应，大于单独作用时的效应之和。累加作用，是指联合作用时的抗微生物效应，等于单独作用时的效应之和。拮抗作用，是指一种成分降低另一种成分的抗微生物效应。无关作用，指的是一种成分(例如对所测菌无活性)的存在并不影响另一种成分的活性。抗生素的相

14、互作用尽管这四种情况在概念上非常清楚和明确，但是造成这几种情况的原因以及描述它们的参数都复杂难懂。要定量测定相互还有一种更简单因而也不太准确的方法检测相互作用。抗生素的相互作用将浸泡有不同抗生素的两个纸条，以90度垂直交叉，放置在涂布有受试微生物的培养皿上。如果纸条相互交叉部分的抑菌带变宽了，说明是协同作用；反之，如果抑制带变窄了，说明是拮抗作用。影响抗生素活性测定的因素 体外抗生素活性的测定受实验条件的影响如培养基组成、细菌接种物密度和接种量。此外，用固体培养基测定时还有一些特殊因素在定量测定抗生素时,其他要考虑的因素1抗生素溶液的体积 如果体积不足孔(或纸片)中的抗生素浓度，由于扩散，会随

15、时间明显变化。因为扩散速率本身介于孔和琼脂间的浓度梯度的函数，这样会造成透明圈的直径出现波动。在定量测定抗生素时,其他要考虑的因素2琼脂的厚度和浓度 当琼脂的厚度较薄时，透明圈会大一些。因而在制备大培养平板时，必须保证板子绝对水平，这样才能制备厚度均一的培养平板。在定量测定抗生素时,其他要考虑的因素关于浊度法，需要专门指出的是, 生长速率与温度关系很大也就是说，试管中间温度的小差异，也会导致大误差。不论测定抗生素的浓度，还是测定菌株的敏感度，情况都是这样。在定量测定抗生素时,其他要考虑的因素上面所讨论的几个因素，只是影响抗生素对细菌的活性的诸多因素中的一部分。在使用抑制细菌生长方法定量测定抗生素活性时，有必要使所有测定条件特定化和标准化，以使不同的实验室之间的数据可以重复。抗菌活性测定的微型化和自动化最近几年，细菌多重耐药性的广泛扩散，在微生物实验室测定的抗菌素谱的需求急剧增加。需要开发简便价廉的微生物技术。这方面的需要主要向两方面发展：微型化自动化抗菌活性测定的微型化和自动化一般在1-2m1体积培养基中进行测试。但是现在、通常在更小的体积如100 l中进行，并且广泛采用塑料板即微孔滴定板(每板96孔，每孔200l。培养基、接种物、抗生素溶液都用多孔移液器加入，节省了大量材料和劳力。抗菌活性测定的微型化和自动化已经开发出抑菌圈测读和菌落汁数的自动化系统，由光