肿瘤坏死因子α

1、肿瘤坏死因子摘要恶性月中瘤疾病目前仍是全世界需要共同面对的一个医学难题，其发病隐匿，早期容易被忽视，而临床患者多数已到中晚期，此时的疾病已很难治疗。月中 瘤坏死因子是一种能使月中瘤出血，并能抑制、杀伤体外培养的月中瘤细胞的蛋白类 物质，1984年TNF基因的克隆开辟了临床试验的时代，是第一个用于月中瘤生物 疗法的细胞因子，但因其缺少靶向性且有严重的副作用，对该基因的研究和应用 形成了很大的障碍，目前很多研究人员正致力于该基因改造与应用。关键词TNR月中瘤1TNF的生物学特征TNF按其结构可以分为两种：TNFa和TNF0。TNFa是一种单核因子，主要 由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，TNF0是一

2、种淋巴因子，由活化的T细胞和 NK细胞产生，目前研究多为 TNFa。人的TNFa位于第6号染色体短臂上，与MHC紧密连锁1,人的TNFa基因 大小为2.76kb,由4个外显子和3个内含子组成。TNFa的蛋白质结构有多种形 成，有二聚体、三聚体、五聚体，其中有生物活性的是三聚体。TNF0位于TNFa的5端，同样由4个外显子和3个内含子构成，其中第4个外显子与TNFa高 度同源，编码80%-90%勺成熟蛋白质。TNFa的来源与表达TNFa在人体内的来源途径有很多，如单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成 纤维细胞等都可以在一定的条件下产生和释放TNFa。目前认为TNFa主要的生物合成场所有心、肝、肺、肾

3、2。各种外来刺激如内毒素脂多糖（LPS）肠毒素、 霉菌抗原、某些寄生虫的溶解物、病毒颗粒等，均可以引起TNFa的表达与释放。在正常情况下，TNFa只由心肌间质的巨噬细胞产生，在某些病理状态下， 如感染或内毒素的刺激下，心脏可以产生 TNFa , Giroir3等研究证实这一点，在 这些应激状态下，成熟的心肌细胞同样可以产生TNFa mRNA及其蛋白质，且产生的量同巨噬细胞产生的差不多。Kleine等4证实，在生理状态下，脑内在结构和功能方面与巨噬细胞相似的 细胞如神经元、小胶质细胞、血管内皮细胞均可合成分泌 TNR IL-6等细胞因子。 在炎症情况下，这些细胞因子的水平明显升高，且对中性粒细胞

4、有明显趋化作用 5。有研究表明，有大约20%的恶性月中瘤的发生与慢性炎症有关6。TNFa受体通过对TNFa分子一级结构的研究表明，C-末端在TNFa的生物学活性中起 决定性作用。由于C-末端参与TNFa高级结构的构成，只要切掉1个氨基酸就可 使TNFa丧失生物学活性。而N-末端的变化范围较大，适当改变其长度并不影响 其生物学活性，N-末端还与TNFa对受体的结合能力密切相关，可能为与受体结 合的部位。TNFa生物学效应的发挥，有赖于其与靶细胞上的TNFR相结合，并通过受 体后效应将信号传至胞核。TNFR存在于多种细胞表面,月中瘤细胞表面同样也存 在TNF印，不同细胞表面上受体的数目以及亲和力都

5、有所不同，且这些差异不 呈平行关系。TNFa受体可分为2种，即TNFRI和TNFRI ,两类TNFR均为糖蛋白，两类 受体胞外区域氨基酸序列相似度很高， 但胞内区域则完全不同。由于各种细胞表 达TNFR存在差异，使得TNFa对各种细胞的作用不同，一般来说，受体数目越 高越容易受到TNFa的损伤。TNFR还存在2种可溶性形式，为从细胞膜上通过蛋白酶水解下来的受体片 段。它们通过与TNFa结合而影响TNFR和TNFa的功能及其含量变化，且影响 效果是显著的。采用表面等离子体共振技术研究表明，TNFa与其可溶性受体的亲和常数远高于一般的抗原与抗体结合的亲和力8。TNFa的生物学活性TNFa在体内、体

6、外均能杀死某些月中瘤细胞，或抑制其增殖作用。 TNFa杀伤月中 瘤的机理还不十分清楚，与补体或穿孔素杀伤细胞相比， TNFa杀伤细胞没有穿 孔现象，而且杀伤过程相对比较缓慢。TNFa能够增加过氧化物阴离子产生，增强 ADCC功能，刺激细胞脱颗粒和 分泌髓过氧化物酶，促进中性粒细胞粘附到内皮细胞上， 从而刺激机体局部炎症 反应。TNFa促进T细胞MHCI类抗原表达，增强IL-2依赖的胸月M细胞、T细胞增 殖能力，促进IL-2、CSFffi IFN-丫等淋巴因子的产生，增强有丝分裂原或外来抗 原刺激B细胞的增殖和Ig分泌。TNFa与临床TNFa是目前发现的抗月中瘤活性最强的细胞因子。在许多疾病，如

7、心血管疾 病、恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎、多发性硬化 症、炎症性肠病、移植物抗宿主病和骨髓造血紊乱综合症等的病理生理过程中起 着重要的作用9。TNFa除了对月中瘤细胞本身具有细胞毒性之外，它也能摧毁实体瘤周围的血 管上皮组织，并且通过血栓的形成，阻断月中瘤的血液营养供应，最终导致月中瘤的 出血性坏死、消退或消失。超过一定浓度的 TNFa具有明显的抗新生血管形成作 用。TNFa能明显降低实体瘤周围间隙组织的压力，扩大肿瘤周围上皮组织的问 隙，改变周围血管的通透性，使化疗的药物到达靶组织周围。另外，TNFa通过对人体免疫系统的调节从而加强自身的抗月中瘤作用。TNFa导致

8、的心肌机能障碍包括钙平衡的改变、直接的细胞毒作用、氧化张 力、兴奋-收缩耦联破坏、心肌细胞凋亡等。研究表明，严重的充血性心力衰竭、 心肌梗死、心肌炎、扩张性心肌病、心脏移植排斥反应和进行心肺旁路手术患者 的血浆TNFa水平显著升高。TNFa的制备常用制备TNFa的方法有体内法、体外法和基因工程法。体内法将卡介苗和LPS注入实验动物体内，诱导体内TNFa的产生。外周血单个核细胞在重组白介素-2 和有丝分裂原刺激下，或在十四酰沸波乙酸酯和LPS乍用下均能产生TNFa ,此法可在体外大量收集细胞培养物， 实现批量生产。分子生物学技术的应用，极大 的促进了人TNFa的制备工作。人TNFa的氨基酸序列已

9、弄清楚，并克隆出编码 TNFa蛋白质的cDNA。利用基因工程法可获彳#高活性、高纯度的 TNFa。基因工程法制备1)改造TNFa的分子结构分析hTNFa的空间结构是研究新型 hTNFa的前提。具有生物活性的 hTNF a其空间结构是3个TNFa单体以边对面形式形成的近似三角锥形的三聚体，结构与功能研究表明，删去N端前7个氨基酸残基不影响hTNFa三聚体空间结构。 相反，在删去N端7个氨基酸的同时增加N端的碱性氨基酸，可以增强形成活 性三聚体的能力，从而提高hTNFa的抗肿瘤活性10。何晓龙等11构建了 3种hTNFa的衍生物。这三种衍生物比以往报道的单独 缺失N端氨基酸或单独增强N端碱性氨基酸

10、引起的活性升高要大得多，说明两 种突变在提高TNFa的细胞毒活性方面具有协同作用，具有潜在的临床应用前景。2)制备TNFa融合蛋白.具有TNFa抗月中瘤活性和靶细胞专一性的融合蛋白借助于细胞因子与其受体的特异性，hTNFa融合蛋白可以导向杀伤那些 表达受体的月中瘤细胞。刘丽等12针对TNFa在月中瘤治疗剂量下产生的严重毒 副作用及一些月中瘤细胞白介素-6受体明显增高的事实，采用PC叱术将TNF a突变体与人IL-6成熟肽链编码区cDNA通过人工接头进行融合，并将融合 的蛋白在大肠杆菌中表达，经活性检测结果证实，该融合蛋白在具有TNFa的对L929细胞和人骨髓瘤细胞的细胞毒作用和结合 IL-6受

11、体的能力，在高 表达IL-6受体的人骨髓瘤细胞上测得的细胞毒活性教同样位点突变的TNFa高约3倍。国内比较成功的例子是抗肝癌单链抗体融合 TNFa的双功能抗体。陈波 等13将hTNFa同带有肝细胞特异结合位点的乙肝病毒表面抗原 pre(1-65)肽 段进行融合表达，并在融合蛋白之间加入了连接肽段或凝血酶酶切位点，获 得了 TNFa与preS1融合蛋白的表达产物，该产物具有TNFa的对L929细胞 的细胞毒活性。.具有双重活性的融合蛋白构建融合蛋白不仅要考虑其靶向性，还要增加其功能。IL-2和TNFa是引人注目的抗月中瘤活性因子，两者在抗月中瘤及免疫调节方面 具有协同作用。颜世庆等14利用逆转录

12、病毒载体构建了包括编码 IL-2前导肽和 TNFa成熟肽序列的融合基因，表达的融合基因产物在体内和体外都对月中瘤细胞 的生成具有抑制作用。高长寿等15将人a降钙素基因相关肽与hTNFa高效融合表达，表达的融合蛋白 既有CGRFP勺结合活T又有hTNFa的活性。7检测方法生物学检测方法：常用TNF对月中瘤细胞的细胞毒作用的强弱来判断它的活性。 检测TNF对靶细胞的细胞毒作用的指标主要有：胎盼兰活细胞计数法，中性红细胞 摄入法，结晶紫染色法，MTT法，荧光素标记法等。免疫学检测方法：免疫学检测主要是根据TNF分子本身具有抗原性的特点，与 抗TNF抗体发生特异性结合，具有较高的灵敏度和特异性。与生物

13、学检测相比，免疫学检测方法由于不需要进行细胞培养，从而大大简化 了操作过程,使得临床检测TNF成为可能。近几年基因工程的迅速发展，也为免 疫学检测方法提供了大量高纯度的 TNF标准品。8结语TNFa是由激活的单核细胞、巨噬细胞产生的一种具有多种生物活性的多肽细 胞因子，与机体免疫反应、急性期反应及炎症反应关系密切， 它可通过激活细胞 因子网络系统而诱发全身炎性反应，导致血液动力学改变、心肌抑制、微血管损 伤及急性肺间质损伤等。运用正确适当的抗TNFa治疗将可能成为一种新的治疗 疾病的方法，但其临床应用价值还有待于进一步的证实。参考文献Nedwin GEE, Naylor SL Sakaguch

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