高效液相色谱仪原理以及应用

1、关于高效液相色谱仪的原理及应用第一张，PPT共五十二页，创作于2022年6月高效液相色谱 high performance liquid chromatograph，HPLC第二张，PPT共五十二页，创作于2022年6月第三张，PPT共五十二页，创作于2022年6月Agilent 1100第四张，PPT共五十二页，创作于2022年6月气相色谱法：较易挥发、且热稳定的有机化合物。20%液相色谱法：用气相色谱法难以分析的物质，如难挥发、热不稳定、分子量大、具有生物活性的物质。80%第一节 高效液相色谱法的原理一、高效液相色谱法的特点第五张，PPT共五十二页，创作于2022年6月 高效液相色谱法与经

2、典液相色谱法经典液相色谱法高效液相色谱仪经典液相色谱HPLC固定相粒径150-200 m3-10 m流动相驱动方式重力或低压泵高压泵流动相流速很慢快(1-10mL/min)例：分离20种氨基酸柱长：170 cm柱径：0. 9 cmF：30 mL/ht : 20 h经典柱色谱HPLCt ：1 h高压、高效、高速 第六张，PPT共五十二页，创作于2022年6月吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 排阻色谱二、高效液相色谱法的分类正相色谱 反相色谱1、按分离原理分类2、按极性分类第七张，PPT共五十二页，创作于2022年6月1)吸附色谱（液-固）固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m

3、的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相上的吸附与解吸。 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样。1、按分离原理分类第八张，PPT共五十二页，创作于2022年6月2)分配色谱（液-液） 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 固定相：由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体表面涂渍固定液，固定液易流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面。C-18柱:第九张，PPT共五十二页，创作于2022年6月3)离子交换色谱 固定相：阴离子离子交换树脂 或阳离子离子交换树脂； 流动相：酸性或碱

4、性水溶液； 基本原理：利用不同离子对树脂的离子交换能力不同来实现分离。应用：离子及可离解的化合物， 氨基酸、核酸等。第十张，PPT共五十二页，创作于2022年6月4)排阻色谱（又称凝胶色谱） 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快。 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。 第十一张，PPT共五十二页，创作于2022年6月1) 正相色谱： 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的色谱体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表

5、性的流动相是正己烷。 2) 反相色谱： 由非极性固定相和极性流动相所组成的色谱体系，与正相色谱体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今HPLC最主要的分离模式。2、按极性分类:第十二张，PPT共五十二页，创作于2022年6月第十三张，PPT共五十二页，创作于2022年6月第二节 高效液相色谱仪的组成输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统第十四张，PPT共五十二页，创作于2022年6月一、输液系统 高压输液泵脱气装置梯度淋洗系统第十五张，PPT共五十二页，创作于2022年6月1、高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。

6、为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。L/min几千mL/min应具有压力平稳、流量稳定可调、耐腐蚀等特性第十六张，PPT共五十二页，创作于2022年6月2、脱气装置 用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。 脱气机、超声脱气、真空脱气等。 第十七张，PPT共五十二页，创作于2022年6月3、梯度淋洗装置第十八张，PPT共五十二页，创作于2022年6月等度洗脱输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂第十九张，PPT共五十二页，创作于2022年6月分析时间长分离度差 MeOH

7、/ H2O = 6 / 4MeOH / H2O = 8 / 2等度洗脱怎样解决呢？第二十张，PPT共五十二页，创作于2022年6月梯度洗脱 A 泵进样器色谱柱柱温箱检测器 B泵AB时间 B 浓度第二十一张，PPT共五十二页，创作于2022年6月95%30%MeOH梯度洗脱优点：可提高分离度、缩短分离时间、 降低最小检测量和提高分离精度。第二十二张，PPT共五十二页，创作于2022年6月 气相色谱的程序升温第二十三张，PPT共五十二页，创作于2022年6月程序升温50250，8/min恒温150 正构烷烃恒温和程序升温色谱图比较程序升温不仅可以改善分离，而且可以缩短分析时间。 气相色谱：第二十四

8、张，PPT共五十二页，创作于2022年6月 流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置：二、进样系统第二十五张，PPT共五十二页，创作于2022年6月 色谱柱： 填料： C18色谱柱 十八烷基硅基化学键合 到多孔硅胶或陶瓷微粒 SIL 多孔硅胶微粒 XDB-C8 辛基硅烷化学键合到 多孔硅胶微粒上三、分离系统第二十六张，PPT共五十二页，创作于2022年6月 目前应用最广、性能最佳的固定相。 a. 硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：SiOSi C c. 硅碳键型： SiC d. 硅氮键型： SiN化学键合固定相:第二十七张，PPT共五十二页，创作于2022年6月 1、紫

9、外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 参考二极管UV 灯光栅样品池采样二极管滤光片狭缝镜2镜1四、检测系统第二十八张，PPT共五十二页，创作于2022年6月2、光电二极管阵列检测器 DAD 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。第二十九张，PPT共五十二页，创作于2022年6月3、荧光检测器 高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃、维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。第三十张，PPT共五十二页，创作于2022年6月4、质谱检测器 第三十一张，PPT共五十二页，创作于2022年6

10、月一、定性分析(1) 保留值定性(2) 相对保留值定性(3) 与其他仪器联用标准品：A-甲醇；B-乙醇；C-正丙醇； D-正丁醇；E-正戊醇第三节 高效液相色谱法的应用第三十二张，PPT共五十二页，创作于2022年6月 组分的峰面积越大, 在样品中所占比例越大?1、校正因子定量： fi 称为校正因子。 fi 0？同一检测器，对不同组分的敏感度不同。Wi = fi AiWi = fi Ai二、定量分析方法：第三十三张，PPT共五十二页，创作于2022年6月校正因子fi 分为绝对和相对校正因子两种。绝对校正因子： 由于受到仪器及操作条件的影响程度很大，实际定量分析时，基本上不使用。第三十四张，PP

11、T共五十二页，创作于2022年6月 相对校正因子 fi ： 某物质 i 与一选择的标准物质 S 的 绝对校正因子之比: 相对校正因子只与检测器类型有关，而与色谱条件无关。 常用于作为标准物质S的有苯（热导检测器）和庚烷（氢火焰离子化检测器）等。选择的标准物质S一起加入试样中 内标法：第三十五张，PPT共五十二页，创作于2022年6月2、内标法 标准物质在未知样内部内标物应满足的要求（p55)： 准确称取一定量的未知样Wi，加入已准确定量的内标物WS。SampleStandardsi校正曲线：Ai/AsCiis第三十六张，PPT共五十二页，创作于2022年6月内标法的优点：氯霉素测定：1. 用外

12、标法： 先做氯霉素标准品，C=1ug/uL，进样量10uL, 测得A = 1000, 则 W = 1ug/uL 10uL=10ug, f = W/A = 10ug/1000 = 0.01ug; 再做未知样(含氯霉素?ug/uL)，进样量10uL,测得Ax = 500, 则 Wx = f Ax = 0.01ug 500 = 5ug, Cx = 5ug/10uL = 0.5ug/uL; 假若由于某种原因，未知样实际进样量只有9.90uL, 但计算时仍按10uL算： 则可测得Ax变为495，Wx = fi Ax = 0.01ug 495 = 4.95ug, Cx = 4.95ug/10uL = 0.

13、495ug/uL。第三十七张，PPT共五十二页，创作于2022年6月2. 用内标法： 先做 氯霉素(i) + 对硝基苯酚(s) 标准品， 标准品中，氯霉素Ci=1ug/uL，对硝基苯酚Cs =2ug/uL； 进样量10uL, 测得氯霉素Ai = 1000, 对硝基苯酚As = 100。 则 氯霉素Wi = 1ug/uL10uL=10ug, fi = Wi/Ai = 10ug/1000 = 0.01ug; 对硝基苯酚Ws = 2ug/uL10uL=20ug, fs = Ws/As = 20ug/100 = 0.2ug; 相对校正因子f= fi / fs = 0.01ug/0.2ug = 0.05

14、; 再做未知样(氯霉素?ug/uL +对硝基苯酚0.5ug/uL)，进样量10uL, 可测得氯霉素Ai = 500, 对硝基苯酚As = 25, f= fi / fs = (Wi/Ai)/(Ws/As) = 0.05; Ws = 0.5ug/uL 10uL = 5ug， Wi = f (Ws/As) Ai = 0.05 (5/25) 500 = 5ug, Cx = 5ug/10uL = 0.5ug/uL;第三十八张，PPT共五十二页，创作于2022年6月 假若由于某种原因，导致未知样实际进样量只有9.90uL, 但计算时仍按10uL算： 则可测得氯霉素Ai变为495，对硝基苯酚As 也变为24

15、.75； f= 0.05; Ws = 0.5ug/uL 10uL = 5ug； Wi = f (Ws/As) Ai = 0.05 (5/24.75) 495 = 5ug, Cx = 5ug/10uL = 0.5ug/uL。第三十九张，PPT共五十二页，创作于2022年6月例： 一含氯霉素试样，称取此样 1.000g，以对硝基苯酚作内标，称取 0.100g 对硝基苯酚加到试样中，混合均匀后进样，测得氯霉素峰面积是20，对硝基苯酚峰面积是120，已知氯霉素相对于对硝基苯酚的相对校正因子是1.2，求试样中氯霉素的含量。 f i = （Wi /20）/（0.100/120）= 1.2 w i = 0.

16、020 g Ci = 0.020 / 1.000 = 2.0%第四十张，PPT共五十二页，创作于2022年6月 3、外标法 标准物质在未知样外部即标准曲线法。特点： 不必使用校正因子。 操作条件变化对结果准确性影响较大。 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。第四十一张，PPT共五十二页，创作于2022年6月 4、归一化法： i前提：所有组分都能从柱上洗脱并能被检测器检测。第四十二张，PPT共五十二页，创作于2022年6月例1、高效液相色谱法测定奶粉中的三聚氰胺（1）提取：称取0.53 g奶粉试样，加入0.1 mol/L盐酸至15 ml，混匀，超声提取30 min后加入60

17、 g/L磺基水杨酸34 ml，再用0.1 mol/L盐酸定容至20 ml，混匀后以4000 r/min离心5 min，上清液经0.45m的微孔滤膜过滤后进样。（2）分析：色谱柱:色谱柱Kromasil KR100-5C8(250 mm4.6 mm，5m， Eka Chemicals公司，瑞典) 柱温: 40。流动相:缓冲液+乙腈(85+15，体积比);流速:1.0 ml/min; 进样量:20l。二极管阵列检测器， 波长范围200400 nm。第四十三张，PPT共五十二页，创作于2022年6月第四十四张，PPT共五十二页，创作于2022年6月例2、液相色谱法测定食品中苯并(a)芘原理： 样品经

18、过提取、皂化以及柱层析净化，除去脂肪类物质、色素等杂质后，再通过液相色谱仪中的色谱柱，将苯并芘从多环芳烃物质中分离出来。求出样品中苯并芘的含量。仪器： (1)液相色谱仪： 色谱柱：ODS柱，柱长250mm，4mm； 柱温：30； 流动相：75甲醇； 流速：2mLmin。 (2)检测器：荧光检测器，激发波长369nm，荧光波长405nm。第四十五张，PPT共五十二页，创作于2022年6月操作步骤： (1) 定性测定 用微量注射器吸取一定量的苯并芘标准溶液和样液，注入色谱仪内，根据苯并芘的出峰保留时间和样品中加标准样产生重叠的情况进行定性。 (2) 标准曲线的绘制 用微量注射器准确吸取每1mL含1g的苯并芘标准溶液1、2、3、4、5uL按照上述实验条件进行操作，以获得相应的色谱图。然后分别测量各个色谱