连接酶以及其他二

1、关于连接酶及其他二第一张，PPT共四十七页，创作于2022年6月2.修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸 二酯键一、DNA连接酶的基本性质44第二张，PPT共四十七页，创作于2022年6月一、DNA连接酶的基本性质3.连接多个平头双链DNA分子：第三张，PPT共四十七页，创作于2022年6月注意：（1）DNA连接酶只能连接相邻核苷酸之间的切口 （nick）；（2）如果是缺少一个或几个核苷酸的裂口 （gap），DNA连接酶是无法连接的；46第四张，PPT共四十七页，创作于2022年6月（3）DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或 环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须 是双螺旋DNA

2、分子的一部分；（4）DNA连接酶催化的连接反应是需要能量 的：在大肠杆菌或其他细菌中，利用NAD+ （烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），在动物细胞 中及噬菌体中，利用ATP（腺苷三磷酸）。注意：47第五张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶 T4噬菌体RNA连接酶二、DNA连接酶的种类第六张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 T4噬菌体DNA连接酶 该酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，是T4噬菌体基因30编码的产物，分子量为68ku，需要ATP作为辅助因子。两个带有互补粘性末端的双链DNA分子一条带有切口的双链DNA分子两个带有平头末端的

3、双链DNA分子DNA-RNA杂合体分子中切口该酶可连接49第七张，PPT共四十七页，创作于2022年6月第八张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 大肠杆菌DNA连接酶 该酶是从正常的大肠杆菌中提取的，由大肠杆菌基因组中lig基因编码，分子量为75ku，需要NAD+作为辅助因子。 具有同源互补粘性末端的不同DNA分子 一条带有切口的双链DNA分子该酶可连接但,该酶几乎不能催化两个平头末端DNA分子的连接第九张，PPT共四十七页，创作于2022年6月T4噬菌体DNA连接酶 该酶在DNA体外重组中比大肠杆菌DNA连接酶应用广泛(既能连接粘性末端,也能连接平头末端).两种酶各自的优点大肠杆菌DN

4、A连接酶: 该酶的连接产物转化细菌后,假阳性背景低(由于它对DNA末端的要求比较严格-互补粘性末端).52第十张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 T4噬菌体RNA连接酶 T4噬菌体RNA连接酶由T4噬菌体基因63编码,需要ATP作为辅助因子. 连接反应: 主要用途: 对RNA进行3末端标记,即将32P标记的3,5-二磷酸单核苷加到RNA的3端. 该酶可催化单链DNA或RNA的5磷酸与相邻的3 羟基、单核苷酸共价连接.53第十一张，PPT共四十七页，创作于2022年6月第三节 DNA聚合酶一、DNA聚合酶的分类根据DNA聚合酶所使用模板的不同,可分为:依赖于DNA的DNA聚合酶依赖于RN

5、A的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶Klenow大片段酶T4噬菌体 DNA聚合酶T7噬菌体 DNA聚合酶Taq DNA聚合酶逆转录酶55第十二张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 大肠杆菌DNA聚合酶1.DNA聚合酶的分类 目前,从大肠杆菌中已分离出3种DNA聚合酶,分别为:DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶 : 与DNA复制有关主要参与DNA的修复分子克隆中常用DNA聚合酶第十三张，PPT共四十七页，创作于2022年6月2.大肠杆菌DNA聚合酶的性质 大肠杆菌DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶是Kronberg等1956年发现的第一个DNA聚合酶,故也称为Kronberg酶. 5 3

6、DNA聚合酶活性 大肠杆菌DNA聚合酶(DNApol)发挥聚合酶活性需要:DNA模板、引物、dNTP和Mg2+。57第十四张，PPT共四十七页，创作于2022年6月2.大肠杆菌DNA聚合酶的性质 3 5核酸外切酶活性 大肠杆菌DNA聚合酶 该活性识别单链，能将复制过程中3端的错配碱基切除，从而保证DNA复制的高保真度，也称为校对功能。DNApol53558第十五张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 5 3核酸外切酶活性 大肠杆菌DNA聚合酶2.大肠杆菌DNA聚合酶的性质5353553353553355335 -P53535353553355335 -P第十六张，PPT共四十七页，创作于2

7、022年6月5 3外切核酸酶活性的水解作用有3个特征： 待切除的核酸分子必须具有5端磷酸基团。 核苷酸分子被切除前位于已配对的DNA双螺 旋区段上。 被切除的核苷酸既可以是DNA也可以是RNA. 5 3核酸外切酶活性2.大肠杆菌DNA聚合酶的性质第十七张，PPT共四十七页，创作于2022年6月2.大肠杆菌DNA聚合酶的用途 合成ds-cDNA第二链（Double stranded) 杂交探针的制备 DNA序列分析在DNA聚合反应体系中，如果加入放射性核素标记的核苷酸，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子，这就是所谓的DNA分子杂交探针(书P36）。第十八张，PPT共

8、四十七页，创作于2022年6月杂交探针的制备过程:3553355335533*553*DNAaseE.Coli DNA pol*dNTP图切口平移反应原理62第十九张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 Klenow 片段1. Klenow 片段的由来E.coli DNA pol 蛋白酶较小片段较大片段(Klenow片段)5 33 5聚 外合 切酶 酶活 活性 性性质5 3外切酶活性第二十张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 Klenow 片段的由来 通常所用的Klenow片段是由枯草杆菌蛋白酶切割完整的DNA聚合酶片段而成,或是经过克隆产生的一条多肽链。 Klenow 片段第二十一

9、张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 Klenow 片段2. Klenow 片段的用途 填补由DNA限制酶反应产生的凹陷3末端。 用32PdNTP填补凹陷的3末端，即DNA分 子的末端标记（书P32）。 在cDNA克隆出来后，合成cDNA第二条链。 用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA序列分 析等。65第二十二张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 T4DNA聚合酶1. T4 DNA聚合酶的性质T4DNA聚合酶的外切酶活性比Klenow片段高1001000倍与Klenow片段不同具有5 3聚合酶活性具有3 5外切酶活性与Klenow片段相同不具有5 3外切酶活性66第二十三张，

10、PPT共四十七页，创作于2022年6月 T4DNA聚合酶2. T4DNA聚合酶的用途 填补或标记由限制酶切割DNA后产生的凹陷3末端，标记反应时需要高浓度的dNTP，以保证聚合反应（填补）大于3 5核酸外切酶活性。 进行3突出末端的DNA末端标记。67第二十四张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 T4DNA聚合酶2. T4DNA聚合酶的用途 标记用作杂交探针的DNA片段。 由3 5核酸外切酶活性部分酶切双链DNA，得到凹缺3末端用32PdNTP填补（取代合成）。 将双链DNA的末端转化成平头末端。 利用T4DNA聚合酶的3 5核酸外切酶活性从双链DNA上切除突出3末端，在高浓度dNTP中

11、模板上双链区的降解与合成达到平衡。68第二十五张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 Taq DNA聚合酶 1.来源 Taq DNA聚合酶最初是从耐热细菌Thermusaqraticus中纯化而得，因此是一种单亚基耐热的依赖DNA的DNA聚合酶，现已广泛用于基因工程的操作中。69第二十六张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 Taq DNA聚合酶70 2.性质 具有5 3聚合酶活性 最适反应温度为7580（据目的序列不 同而不同） Taq DNA聚合酶在60时其聚合酶活性下降2倍，在37时下降10倍。第二十七张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 Taq DNA聚合酶 3.用途 T

12、aq DNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应（PCR），在体外扩增特定的DNA片段，DNA或单链cDNA都可作为起始模板。但在使用中应注意： Taq DNA聚合酶需要Mg2+。磷酸缓冲液抑制该酶活性，应避免使用。71第二十八张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 逆转录酶一、一般知识 依赖于RNA的DNA聚合酶或RNA指导的DNA聚合酶。分子量约为16万，由分子量分别为6.2万和9.5万的两个结构相关的亚单位组成。72第二十九张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 逆转录酶二、来源 逆转录酶最主要的来源是鸟类成髓细胞性白血病病毒（AMV）。三、特性AMV逆转录酶的活性首先表现为DNA聚合酶

13、的活性. 模板既可以是DNA,也可以是RNA.在以RNA为模板是称为RNA指导的DNA聚合酶活性,而以DNA为模板是则叫做DNA为指导的DNA聚合酶.73第三十张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 逆转录酶三、特性 AMV逆转录酶的活性其次表现为RNaseH活性。 此酶可以特异性降解RNA-DNA杂种双链中的RNA部分。 另外，还具有DNA内切酶活性和核酸结合活性。74第三十一张，PPT共四十七页，创作于2022年6月 逆转录酶四、用途 逆转录酶在基因工程中可用于cDNA的合成。即可将任何真核基因的mRNA经反转录形成cDNA拷贝,然后构建克隆,大量扩增,并表达这种基因,从而为真核基因的

14、研究与其核遗传工程提供了一项必不可少的手段。75第三十二张，PPT共四十七页，创作于2022年6月一、性质 末端转移酶催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3-OH末端。 这很像DNA聚合酶通过5 3聚合5-脱氧核苷三磷酸合成一条DNA链。所不同的是末端转移酶不需要模板。第四节 末端转移酶76第三十三张，PPT共四十七页，创作于2022年6月二、用途主要用途是给载体和外源DNA分别加上互补的同聚物尾巴，以便二者在体外连接。进行DNA3-OH末端标记。 标记物可以是放射性的，如-32P-dNTP,也可以是非放射性的,如生物素-11-dUTP（生物素和亲和素）,它们可用于DNA序列分析、DNase足迹分

15、析、分子杂交等实验中。77第三十四张，PPT共四十七页，创作于2022年6月二、用途 进行同聚物接尾 用末端转移酶给一群DNA分子3-OH末端接上oligo（dA）或（dG）,给另一群DNA分子3-OH末端接上oligo（dT）或（dC）,混合这两群分子,就能使末端转移酶接上的同聚物尾部退火形成环状分子。这种方法称为同聚物接尾法。78第三十五张，PPT共四十七页，创作于2022年6月第五节 核酸酶 核酸酶是一类能降解核酸的水解酶，它在基因工程操作中应用非常广泛。根据核酸酶对底物作用的专一性，可将其分为三类： 核糖核酸酶（RNase）：只作用于RNA。 脱氧核糖核酸酶（DNase）：只作用于DN

16、A。 核酸酶（nuclease）：既作用于DNA，又 作用于RNA。79第三十六张，PPT共四十七页，创作于2022年6月一、核酸外切酶（exo ） exo是一种的单链核酸外切酶，它能够从5末端或3末端降解DNA分子，产生出寡核苷酸短片段，且不需要Mg2+的参与。第三十七张，PPT共四十七页，创作于2022年6月二、核酸外切酶（exo ） 该酶可以从双链DNA的3-OH末端起逐一切去5单核酸,其作用底物为含切口或缺口的线性双链DNA和开环DNA。作用后在双链DNA上形成一条长的单链区,这种外切酶不能降解单链DNA和带突出3末端的双链DNA。81第三十八张，PPT共四十七页，创作于2022年6月

17、二、核酸外切酶（exo ）第三十九张，PPT共四十七页，创作于2022年6月三、核酸酶S1 1.基本知识 核酸酶S1是从米粉状曲菌（Aspergillus oryzae）提取带的一种金属蛋白，分子量32 000（32 ku），相对耐热，催化反应通常需要Zn2+和酸性条件，产生带5磷酸的寡核苷酸。83第四十张，PPT共四十七页，创作于2022年6月2.特性 降解单链DNA或RNA,包括双链分子中的单链区域(如发夹结构),这种单链区域甚至可以小到1个碱基对的程度。 降解单链DNA的速度比RNA的速度快10倍。 降解发应的方式为内切和外切。 降解发应的最适pH为4.04.5。 酶量过大时，伴有双链核酸的降解，该酶的双链降解活性仅为单链的1/75 000。第四十一张，PPT共四十七页，创作于2022年6月核酸酶S1的基本反应：内切单链DNA或RNA第四十二张，PPT共四十七页，创作于2022年6月核酸酶S1的基本反应：内切带切口或缺口的双链DNA第四十三张，PPT共四十七页，创作于2022年6月3.用途（在DNA上定位RNA）第四十四张，PPT共四十七页，创作于2022年6月四、RNA酶A RNA酶A是一种RNA限制酶，专一性地作用于单链RNA的3端嘧啶残基，切开其与邻近核苷酸相连的磷脂键。产物为带3-P的嘧啶和末端为3-P嘧啶的寡核苷酸。 从DNA-RNA中切除未杂交的RNA区；