重组蛋白分离纯化

1、关于重组蛋白的分离纯化第一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月基因表达体系1. 原核体系2. 真核体系第二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月大肠杆菌 (Escherichia coli)遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰第三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月枯草杆菌 (Bacillus subtilis)分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳定，尚无商品化的表达载体第四张，PPT共一百零五页，创作于2

2、022年6月其 他乳酸菌 (Lactic acid bacteria)沙门氏菌(Salmonella typhimurium)苏云金杆(Bacillus thuringiensis)第五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月真核细胞表达体系酵母细胞昆虫细胞哺乳动物细胞/组织植物细胞/组织第六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月酵母细胞可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;商品化表达体系： 酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）; 毕赤酵母 (Pichia pastoris)

3、; 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）第七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月昆虫细胞可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；糖链有所区别，表达量有限；作为药物宿主细胞未被FDA认可第八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月CHO细胞可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；表达量不够高，培养成本较高第九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月动物乳腺组织分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；转基因动物制作花费巨大，实验

4、周期长第十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月鸟类输卵管组织分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；实验成本低，饲养费用低；加糖方式可能与人有所不同第十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月植物组织植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不方便第十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月体系选择研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭

5、毒单抗生产: 杂交瘤细胞工业酶生产: 各种微生物 第十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月重组蛋白的分离纯化策略 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择第十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月针对不同的产物表达形式采取不同的策略采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化表达在细

6、胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。第十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点处于极端区域（pI5 或 pI8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10-8- 10-4 mol / L）；疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；径向层析是近年来发展起来的集层析

7、分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。第十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月多种分离纯化技术的联合运用在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段第十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月合适分离纯化介质的选择常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不

8、会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉第十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Protein purificationPreparation of the bacterial lysateIt is a critical step. Optimal conditions maximize cell lysis and the fraction of the recombinant protein that is extracted while minimizing protein oxidation, unwanted proteolysis and sample con

9、tamination with genomic DNA.The lysis buffer should contain a strong buffer to overcome the contribution of the bacterial lysate, high ionic strength to enhance protein solubility, protease inhibitors and a reducing agent such as TECP to prevent oxidation of the protein.第十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Abou

10、t gel filtrationThe choice of gel filtration as the next step after IMAC may be surprising, considering its lower resolving power compared with ion exchange or other adsorption chromatography methods, but this step is often sufficient after IMAC if the protein was abundant in the lysate.Moreover , g

11、el filtration is more generic, can be performed in any buffer condition, and can be used to resolve the oligomerization state of the target protein.Superdex 75 and Superdex 200 prep grade, XK 16/60 columns are most useful for 1-30mg of protein in a sample volume of up to 7.5 ml.第二十张，PPT共一百零五页，创作于202

12、2年6月第二十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月分泌型战略表达重组蛋白的分离纯化策略要分泌的多肽有一个疏水的氨基突出，它负责向内质网的转运这个末端突出通常由大约20个氨基酸组成，并且在内质网中从成熟蛋白上剪切下来。人们已经利用含有合适重组质粒的酵母细胞分泌了大量的非酵母多肽，而且绝大多数情况下都用到了a-因子信号序列。第二十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在N端加入1530个氨基酸组成的信号肽（signal peptides）序列。信号肽N端的最初几个

13、氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶所切割。以分泌型蛋白的形式表达外源基因的优点：分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌后则有活性。第二十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。简化了发酵后处理的纯化工艺。缺点：外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。第二十四张，PPT共

14、一百零五页，创作于2022年6月人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究1、重组载体的构建特导引物设计，以pBV220-ALR质粒为模板扩增目的条带构建酵母表达重组质粒，转化毕赤酵母GS115重组蛋白的表达及鉴定rhALR的纯化第二十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月rhALR的纯化菌液上清经低盐透析后，超过DEAE-Sepharose FF柱的饱和吸附量上样，洗脱组分脱盐后再上DEAE-Sepharose FF 柱，然后再用Sephades G-75 柱进一步纯化。第二十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月离子交换琼脂糖： 离子交换琼脂糖是携带DEAE

15、或CM基团的Sepharose CL-6B DEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因此具有稳定的外形体积。第二十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月离子交换介质的选择原则对pI=5的某酸性蛋白质当蛋白质为阴离子时，在pH5.5-9.0的范围内，应首选DEAE纤维素；当蛋白质为阳离子时，在pH3.5-4.5的范围内，应首选CM纤维素12346789105pH+-蛋白质净电荷等电点吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂pH pI（-）第

16、二十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月What happens in ion exchange?sampleapplicationand washelutionequilibrationregeneration-+-anionexchangerbead第二十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月+-equilibrationanionexchangerbead第三十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月-+-sampleapplicationand wash第三十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月-+-elution第三十二张，PPT共一百零五页，创作于2

17、022年6月-+regeneration第三十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月离子交换层析的基本操作层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致 为准，其中pH值最重要第三十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月离子交换层析的基本操作样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数第三十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月离子交换层析的基本操作样

18、品洗脱恒定洗脱阶段洗脱梯度洗脱102030405060708090分子浓度离子强度pH值第三十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月阴离子交换法色谱条件： DEAE-Sepharose FF 阴离子交换填料；XK26/20色谱柱，体积89.32ml; 8ml/min; 0.2灵敏度A液： 5ommol/L Tris-Hcl (pH8.0)B液：50mmol/L Tris-Hcl+1 mol/NaCl (pH8.0)以A液为平衡液，B液为100%洗脱液，各洗脱浓度由Pharmacia FPLC系统自动将A液和B液混合产生。第三十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月阴离子交换层析

19、：透析上清超过饱和吸附量上样后，目的蛋白主要集中在0.1mol/L NaCl洗脱峰，但还含有很多杂质；在1mol/L NaCl 洗脱峰中只存在少量目的蛋白超饱和上样的0.1mol/L NaCl 洗脱峰脱盐后再上样，目的蛋白集中在0.2mol/L NaCl 洗脱峰，杂质含量已较少。第三十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第三十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月凝胶层析凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶介质的选用原则凝胶层析的基本操作第四十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月凝胶层析的基本原理 凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份

20、按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛 分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们下行速度快 分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢 鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及分离纯化。第四十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月凝胶介质的基本性质 葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解 湿态的

21、葡聚糖可加热到110，干的则能耐受120高温葡聚糖凝胶（ Sephadex ） Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶 质的凝胶过滤 第四十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月凝胶介质的选用原则 将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G-组别分离15、Bio-Gel

22、 P-2或P-4第四十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离该策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由分级分离于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。第四十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月凝胶层析的基本操作平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速注意凝胶的断层和气泡层析柱平衡操作压控制平衡和洗脱时应维持流速恒定恒定的操作压是恒流的先决条件第四十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年

23、6月上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：进样体积进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好第四十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月凝胶色谱层析色谱条件：Sephadex G-75凝胶填料；XK16/80色谱柱，体积160.75ml;1ml/min;0.2灵敏度。洗脱液：0.9%NaCl (pH5.5)第四十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月 洗脱第1峰主要为rhALR四聚体；洗脱第2峰为目的蛋白峰，rhALR二聚体，纯度大于95%，rhALR最后得率为52%。第四十八张，PPT共一百零五页，创

24、作于2022年6月包涵体型战略表达重组蛋白的分离纯化策略包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。包涵体存在部位：细胞质、细胞周质第四十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月包涵体的组成蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物：占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。：包括DNA、RNA和脂多糖等。包涵体形成的本质是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面：折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的

25、蛋白质的聚集作用；蛋白质折叠中间体的作用。第五十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月 当重组蛋白以包涵体形式存在时，可获得高表达、高纯度的重组蛋白，避免蛋白酶对外源蛋白的降解，但不具有生物活性。 要对其进行分离纯化，就需要对包涵体进行变复性处理。然而不论以那种表达形式产生的重组蛋白。其纯化的方法都与传统的生物大分子分离方式相似。包涵体的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异。即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。 由于包涵体难溶，必须首先将其溶解后才能进行蛋白纯化，可以用变性剂(尿素或盐酸胍)溶解包涵体，这样获得的重组蛋白产量虽高，却会破

26、坏蛋白质的二级结构，需经蛋白复性才可能恢复它的生物活性。包涵体的分离纯化第五十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月主要方法金属亲和层析凝胶过滤层析离子交换层析疏水层析双水相萃取技术反胶团相转移技术第五十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Interaction between neighboring residues in the 6His tag and Ni-NTA matrix第五十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第五十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第五十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Purification mechan

27、ism of recombinant His- tagged proteinsAdvantages: easy to identify and purify第五十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化1 原核表达载体的构建pUC118-cycDpET-28c(+)EcoR IT4DNA连接酶pET-28c-cycDDH5,鉴定克隆子阅读框架的正确性第五十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第五十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月2 融合基因在大肠杆菌中的诱导表达pET-28c-cycD提取质粒，转入BL21表达宿主

28、30g/ml Kan, LB37 过夜培养，之后按1：100转接OD600 =0.6 IPTG=0.1mmol/L诱导表达，每隔1小时取样，确定最佳时间为4小时第五十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月pET-28c-cycD转化的菌株经IPTG诱导后在分子量约43 000处出现一条蛋白条带。灰度扫描分析表明目的基因在IPTG诱导4h后表达量最大，约占菌体总蛋白的23。分别对表达菌体的裂解上清和沉淀进行12 SDS分析，发现目的蛋白主要分布在裂解沉淀中，说明表达的CyclinD1蛋白以包涵体形式存在。第六十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月3 包涵体的洗涤与变性大量诱导表达

29、后，离心收集菌体0.1倍培养物体积的溶液A悬浮超声裂菌4 000 g于4 离心15 min，回收的沉淀即为粗制包涵体0.5 Triton X-100和2 molL尿素的磷酸缓冲液依次洗涤悬于溶液B搅拌溶解1 h12 500 g，30 min离心，收集上清第六十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月溶液A：20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，0.1 mmol/L PMSF，1 mmol/L巯基乙醇，pH=7.4磷酸缓冲液: 20 mmol/L磷酸钠,500 mmol/L NaCl，pH=7.4溶液B:8 mol/L尿素，20 mmol/L磷酸

30、钠500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，0.1 mmol/L PMSF，1 mmol/L巯基乙醇，pH=7.4第六十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月重组菌制备包涵体经洗涤后，用8 mol/L尿素变性，加到HisTrap HP Ni 螫合亲和层析柱上，利用咪唑置换，洗脱下特异结合的蛋白。洗脱蛋白经12的SDSPAGE分析表明，纯化的表达产物在分子量43 0o0处显示出一条蛋白带，凝胶薄层扫描分析纯度达98 以上。第六十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月4 目的蛋白的亲和层析纯化和复性变性上清微孔滤膜过滤预先用溶液B平衡过HisTrap HP柱l0倍柱体

31、积的缓冲液Bl0倍柱体积的缓冲液C洗柱5倍柱体积缓冲液D特异性洗脱，分步收集，每管约1 mL第六十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月缓冲液C： 缓冲液B中含20 mmol/L咪唑缓冲液D: 缓冲液B中含500 mmol/L咪唑第六十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月收集液进行12的SDS检测合并含有目的蛋白的各管样品，适当稀释，装入透析袋复性含6 molL尿素的磷酸缓冲液4 透析过夜分别用4 mol/L,3 mol/L,2 mol/L,1 mol/L,0.5 mol/L的梯度透析各4 h以上PBS缓冲液透析过夜蛋白溶液在44 下12 500 g离心20 min上清即为可

32、溶性复性蛋白，冻干后备用第六十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月纯化的目的蛋白采取逐步降低尿素浓度的分段透析复性方法，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性，获得复性的重组CyclinD1蛋白的纯度达-98 以上第六十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Western blot检测表达产物BL21(DE3)菌裂解液, 诱导4 h的转化菌裂解液,纯化的融合蛋白SDS电转移至硝酸纤维素(NC)膜上封闭抗CyclinD1单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG进行孵育二氨基联苯二胺(DAB)显色第六十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第六十九张

33、，PPT共一百零五页，创作于2022年6月融合表达蛋白的分离纯化 与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。 目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提高分离纯化的效率，又能在融合蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目标蛋白。金黄色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，His-tag 等是目前常用的与目标基因融合表达的序列。第七十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第七十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第七十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月表

34、达融合蛋白的优点(1)融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。(2)如果大肠杆菌的结构基因是一段信号肽，可产生分泌型产物。(3)可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。(4)原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。(5)目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。第七十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月节杆菌乙内酰脲水解酶与GST蛋白融合表达及纯化GST结合位点第七十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月GST-融合蛋白的表达和纯化流程第七十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月结核分枝杆菌16k

35、Da与GST融合表达及纯化1 、 16kDa基因的扩增与表达载体的构建设计带有酶切位点的上下游引物5-TCAGAATTCATGAAGCTCACCACAATGA-3(EcoRI)5-TCACTCGACCTACGGCTCCCAAATCAGC-3(Sal I)扩增目的基因双酶切产物及载体pGEX-6P-1连接转化大肠杆菌DH5a及JM109感受态细胞双酶切及测序验证第七十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第七十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第七十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月2、融合蛋白在大肠杆菌中的表达挑取阳性克隆接种于LA培养基活化37 ，200r/m

36、in,6h分别取50 L转接于5mL LA37 ,OD600 0.5-0.8加入IPTG 1mmol/L 每隔1h收集菌体重悬菌体SDS检测取少量培养物，离心收集沉淀（作为空白对照）37 ，230r/min,3h第七十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第八十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月3、融合蛋白的纯化收集菌体重悬于裂解液，超声裂菌，离心取上清加入4 mL谷胱甘肽树脂颗粒4 ,230r/min结合3h离心去上清，加入PBS混匀，离心去上清洗涤5次沉淀中加入GST660 L4 ,230r/min,10min离心，上清即为纯化蛋白裂解液：PBS,PMSF:5mg/mL，

37、DTT:5mg/mL,Tween 20: 10mg/mL，溶菌酶:10mg/mL第八十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月第八十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月A strategy for high-level expression of soluble and functional human interferon a as a GST-fusion protein in E.coliConstruction of recombinant pGEX-hIFNa2bexpression vectorhINFa2b cDNA was cloned by an RTPCR

38、approach using mRNA prepared from healthy individual leukocytes exposed in vitro to the Newcastle disease virusThe cDNA corresponding to the IFNa2b published sequence was amplified using a forward primer that introduced an EcoRI site at the 5 end of the gene (5-TGGAATTCTGTGATCTGCCTCAAACCCA-3) and a

39、reverse primer containing the XhoI site at the 30 end of the gene (5-CGCTCGAGTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTC-3)purified PCR productdigested with EcoRI and XhoI restriction enzymesinserted into the plasmid pGEX4T1第八十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Screening of pGEX4T1/IFNa2b recombinant plasmids containing the cDNA

40、sequence encoding hIFNa2b was performed by a restriction mapping analysis using Bgl II restrictionthe nucleotide sequence of the selected clones was checked by automated DNA Sequencing Analysis using the ABI-PRISM377 DNA sequencer第八十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Construction of recombinant pGEX-D-hIFNa2b e

41、xpression vectorThe pGEX-hIFNa2b expression vector was used as the DNA template for site-directed mutagenesis F (TGT GAT CTG CCT CAA ACCCAC) R (GGA GCC ACG CGG AAC CAG)screening of pGEX-D-hIFNa2b mutant clonesby restriction analysis using EcoRI restriction enzyme第八十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Analytical

42、expression of recombinant GST-rhIFNa2bThe Origami B and BL21 E.coli cell lines were transformed with the wild-type pGEX-rhIFNa2b plasmid and the GSTIFN junction re-engineered pGEX-D-hIFNa2b plasmid,using the TSS method following standard protocols.Starter cultures of 5 ml LuriaBertani (LB) medium co

43、ntaining 100 mg/ml ampicillin were inoculated, each with a single E.coli Origami B or BL21 recombinant clone37 ，250r/min, overnightOne milliliter of the overnight culture was added to 100 ml LB medium supplemented with 100 mg/ml ampicillin 37 ,OD600 0.5第八十六张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Monitoring of growth

44、conditions (temperature and IPTG concentration) using E.coli BL21 and Origami B strainseach host strain culture was induced with three IPTG concentrations (0.1, 0.5 and 1 mM) at anOD600 of 0.525 and 37 OD600 =2To check the effects of the inducer (IPTG) concentration and culture growth temperature on

45、 the expression of soluble GST-hIFNa2b wild-type and GST-D-hIFNa2b mutantrecombinant proteins第八十七张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Analysis of the recombinant GST-rhIFNa2b expressed in the E.coli BL21 strain grown 37 . Both intracellular soluble (A) and insoluble (B) protein fractions were loaded on SDSPAGE gel

46、s, and proteins were stained with Coomassie Brilliant Blue R250. Lane M shows the molecular weight standards(RPN756 MW) indicated in kilo Daltons. Lanes 1 and 3 correspond to the protein samples collected from an un-induced culture of E.coli BL21 transformed with pGEX4T-1 and E.coli BL21 transformed

47、 with the pGEX4T1/IFNa2b recombinant plasmid, respectively. Those lines serve as a control of protein expression in non-induced condition. Lane 2 corresponds to the protein sample collected from a 1 mM IPTG-induced culture of E.coli BL21 transformed withpGEX4T-1. This lane serves as a control of GST

48、 parental protein expression. Lanes 46 correspond to the proteins collected from cultures of E.coli BL21 transformed with the pGEX4T1/IFNa2b recombinant plasmid induced, respectively, with 1, 0.5 and 0.1 mM IPTG.solubleinclusion bodies fractions第八十八张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月The presence of GST-hIFNa2b f

49、usion protein in both the soluble and inclusion body fractions was confirmed by western blot analysis using the anti-GST antibody (Fig. 3A).However, the signal from the soluble fraction was much weaker as assessed by analysis of the western blot film using the ImageJ software. We observed an express

50、ion ratio of 67.39% insoluble (present in inclusion bodies) and over 32.61% soluble (present in the soluble fraction) GST-hIFNa2b fusion protein (Fig. 3B).第八十九张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Enhancement of the level of soluble GST-hIFNa2bexpressed in BL21 strain at reduced temperature第九十张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月

51、Extraction of GST-hIFNa2b recombinant proteinInduced and un-induced cell were harvested by centrifugation4000g, 30 min, 4 Washed with buffer A4000g, 30 minProtein extraction was performed by resuspending the cell pellet in one fifth of the original culture volume of buffer BThe cells were disturbed

52、by six 30-s sonication steps4 for 30 min at 13 500 rpm第九十一张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月cell pellets corresponding to insoluble protein fractions (such as inclusion bodies) were washed separately with the same volume of buffer B.Buffer A :10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.3Buffer B

53、 :10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl,pH 7.3 and 1% Triton X-100)第九十二张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Recombinant protein expression analysisAnalyze the intracellular expression of GST-D-hIFNa2b recombinant fusion protein in E.coli host cells, by SDSPAGE Electrophoresis ,using 15% SDS-polyacr

54、ylamidegels.The recombinant fusion protein was detected by western blot-ECL AssaysThe ImageJ software was used to compare fusion protein expression under different growth conditionsThe concentration of GST-D-hIFNa2b in Origami B lysate versus rhIFNa2b obtained after thrombin cleavage and the two-ste

55、p purification was also determined by a quantitative in-house developed ELISA assay. The purity of the recombinant hIFNa2b was checked by analysis of 5-mg recombinant protein on Coomassie Blue and silver-stained SDSPAGE 15% gels.第九十三张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Affinity chromatography step and thrombin cle

56、avage of GST-hIFNa2b recombinant proteinThe supernatant containing the soluble GST-hIFNa2b recombinant protein was loaded on a GSTrap FF affinity columnpre-equilibrated with buffer A, 1 ml/minThe bound material was washed with buffer A until the absorbance at an OD of 280 nm returned to baselineGST-

57、D-hIFNa2b recombinant protein was carried out using six column volumes of elution buffer(0.5 ml/min)第九十四张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月The eluted fractions containing the GST-hIFNa2b recombinant protein were pooled. The purification stages and affinity chromatographic profiles were analyzed by Coomassie Blue

58、-stained SDSPAGE gels and by western blot analysis as described earlierTwenty units of thrombin solution were added to 100 g of eluted fusion protein and incubated at room temperature(+22) for 20 h.Buffer A :10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.3Elution buffer : 50 mM TrisHCl,

59、 10 mM reduced glutathione, pH 8.0第九十五张，PPT共一百零五页，创作于2022年6月Five thrombin concentrations, 10, 20, 50, 100 and 200 U, were used to cleave 100 mg of affinity-purified GST-IFNa2b fusion protein. The cleavage of the GST-hIFNa2b samples using the five thrombin concentration conditions was analyzed on SDS

60、PAGE followed by a western blot analysis using anti-hINFa polyclonal antibody. The cleavage rate was not complete and did not significantly increase when thrombin concentration was increased. Identical results of incomplete cleavage were observed using different sources of thrombin (i.e. different m