薄层色谱、柱色谱及凝胶色谱法

1、薄层色谱、柱色谱及凝胶色谱法 金 敬 杰1 色谱法概述1 发展历史 俄国生物学家茨维特(T s w e t t)首先提出来的。 1903年， T s w e t t柏林会议上宣读了他的研究成果。 1906年，正式发表。 样品：植物色素的石油醚提取液。 柱： CaCO3(固定相） 洗脱剂： 纯石油醚（流动相）。 结果： 有色谱带出现。 实验方法：如图 （1-1） 所示：2石油醚玻璃管CaCO3(粉末）.:. 图1 色谱 31919 T s w e t t逝世，当时他的方法并未引起注意。 1931 R . k u h n（库恩）用该法成功分离了胡萝卜素和叶黄素。 1938 R . k u h n

2、Obtain Noble P rise. 1943 R . k u h n 发明了离子交换色谱。 1944 英国的M a r t i n . J . P和S y n g e .R . L发明了纸色谱。 1948 T i s e l I u s（瑞士）发明了电泳和 吸收分析 。 1952 英国的M a r t I n . J . P和S y n g e .R . L又发明了液相色谱。 41956 V a n . D e c e m t e r 提出了填充柱速率理论: H=A + B/u + Cu S t a h l 发明并完善了薄层色谱。 F l o d i n发明了凝胶色谱。 1958 G o

3、 l a y 发明了毛细管色谱； 氢火焰离子检测器。1969 K i r k l a n d 提出了表面孔度担体的新型填料。 H e r m u n 研制成第一条高效液相色谱仪。1975 H . S m a l l 离子交换柱 1979 D . T. G j e r d e and J .S .F r i t z非抑柱的单柱离子色谱. 总之：1956 Van. D e e m t e r ：柱速率理论。F l o d i n ：凝胶色谱理论。Stahl：薄层色谱。再加上1943年发明的离子交换色谱，使色谱学这门科学开始成为一门独立的学科。5 2 基本原理： 色谱法是一种物理分离方法，即利用不同

4、物质在两相(固定相和流动相)中具有不同的分配系数(或吸附 系数、渗透性等)，当两相作相对运动时，这些物质在二相中反复多次分配，从而使各物质得 到完全的分离。 3 分类： 按固定相和流动相的物态可分为：气相色谱法、液相色谱法; 固定相的操作 方式及形状分类为：柱色谱、纸色谱、薄层色谱； 以分离机制分 类为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色 谱（凝胶色谱）、亲和色谱 6表1-1 色谱法的分类流动相 气体 液体固定相 液体 固体 液 体 固体 吸附剂 健合固 离子交换 凝胶 定相 树脂固定相 外型 柱 柱 柱 平面 平面 柱 柱 柱 柱 气液 气固 液液 薄层 色谱 液固 健 合 离子交 凝

5、胶名称 色谱 色谱 色谱 纸 色谱 色谱 相色谱 换色谱 色谱 GSC LLC TCL LSC BPLC IC GPC PCGLC 7 1.3 几种分析方法比较 色谱 光谱 电化学 化学法分离能力 强 弱 弱 一般定性 弱 强 一般 强定量 强 中 弱 中 一般分析速度 快 快 较快 慢分析范围 常量、微量 微量 常量、微量 常量 发射光谱 原子吸收光谱 Me、无机物 无机分析对象 有机（无机） 吸收光谱、有机、 少部分有机物 （有机） 无机物大部分 特效性 一般 强 一般 弱Me无机物8结论： 色谱法的分离效能是红外光谱、核磁和质谱所不及的,而且一般来说色谱法的灵敏度要比红外光谱高。 色谱法

6、有一个非常大的弱点，就是在缺乏标准样品的,情况下定性比较困难。而质谱法可以测定未知物的分子量,核磁可以测定分子结构，红外光谱法可以测定分子中的官能团，这是色谱法所不及的。 以上看出，色谱定性困难（缺乏标样下），而 质谱 （MS ) 测未知物分子量 核磁 （NMR) 测分子结构 红外光谱（IR) 测分子中的官能团 色谱、质谱、光谱、联用，取长补短，发展迅速、发挥更大 的作用。9 1 薄 层 色 谱 薄层色谱又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；

7、另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。101.1层析原理： 利用吸附剂（硅胶、氧化铝等）对不同组分吸附能力的差异从而达 到分离目的的方法。1.2 薄层层析的作用 （1）分离（0.5g以下） （5）确定组分数 （2）柱层析的先导 （6）定性鉴定 （3）其他分离手段的效果检测 （7）粗略比较含量 （4）监控反应111.3 薄层层析的器材选择 1.3.1 基板：玻璃、塑料、金属箔1.3.2吸附剂：（1）种类： 常用：氧化铝（强极性）、

8、硅胶（中强极性） 不常用：硅藻土、纤维素、糖类、活性碳（2）符号：H无任何添加剂； G加有锻石膏（Gypsum，CaSO41/2 H2O）粘合剂； F加有荧光素（Fluorescein） CMC加有羧甲基纤维素钠（3）粒度：颗粒的大小，表示方法有两种： 目：1cm2内的筛孔数，数目越大，颗粒越小。薄层所用吸附剂颗粒较细，氧化铝 为200目， 硅胶为100150目。12（4）活性： 吸附剂按其含水量的多少各分为五个等级, I级含水量最少，活性最高；V级含水量最多，活性最低；但并不是活性越高分离效果越好，选用哪种活性级别的吸附剂，要用实验的方法来确定。 氧化铝的活化化IV五级，I级的吸附作用太强，

9、V级的吸附作用太弱。所以一般常采用II，III级。 表1 吸附剂活性和含水量的关系活性等级 I II III IV V 氧化铝加水量/% 0 3 6 10 15 硅胶加水量/% 0 5 15 25 38 13（5）酸碱性： 市售氧化铝有酸性、中性、碱性，其蒸馏水洗出液的pH值分别为4、7.5、910；其中以中性氧化铝应用最广，可用来分离各种化合物，特别是那些对酸、碱敏感的化合物。大体分类如下： 碱性氧化铝适用于碳氢化合物、生物碱以及其它碱性化合物的分离。 中性氧化铝应用最广，适用于醛、酮、醌以及酯类化合物的分离。 酸性氧化铝适用于有机酸类的分离。 硅胶没有酸碱性之分141.3.3 展开剂 主要

10、考虑极性、溶解度、沸点等方面，极性大的样品应选用极性较大的展开剂。溶解应适宜，沸点不宜太高。1.3.4 展开槽与展开 展开槽：卧式、立式、下行式15展开：卧式展开槽倾角15；展开剂用量：浸及下端硅胶，但不浸及样点点样端向下，每次只展开一 块，放在正中，以免爬斜（进而展开倾斜）密闭展开，及时画出前沿线。1.3.5 测量与计算：1.3.6 显色： 普适性显色剂：浓硫酸、碘蒸气、荧光素 用显色剂：茚三酮、三氯化铁溶液等 161.4 操作要点和说明薄层色谱法的整个过程包括以下步骤：1.4.1 薄层板的制备 制薄层板的主要原料是吸附剂和粘结剂吸附剂：最常用于 TLC的吸附剂为硅胶 GF254； 硅胶HF

11、254。粘结剂：一般用所羧甲基纤维素钠（CMC），也有用淀粉的。CMC为粉状固 体，用时先加水，水浴上熬成糊状，配成1水溶液。制板：小板的制备：将硅胶加 1 CMC，调成浆状（在平铺玻璃上能晃动但 不能流动），将其涂在载玻片上（ 75 X 25）， 为使其平，可将载玻片 用手端平晃动，致坦平为止，放在干净平坦的台面上晾干之后放入110 烘箱活化1小时即可使用（一次可做很多 块）。17 图2 薄层板制备181.4.2 点样 点样用的毛细管为内径 lmm的管口平整的毛细管，将样品溶于低沸点的溶剂（乙醚、丙酮、乙醇、四氢呋喃等）配成1溶液。 点样前，可先用铅笔在小板上距一端5mm处轻轻划一横线，作为

12、起始线，然后用毛细管吸取样品在起始线上小心点样，如需重复点样，则应待前次点样的溶剂挥发后方可重点。若在同一块板上点几个样，样品点间距离为5mm以上。 图3 点样191.4.3展开 展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂 的活性等因 素来考虑。 薄层的展开在密闭的容器中进行。先将选择的展开剂放入色谱器中（小板可用广口瓶代替），使色谱器内空气饱和510min，再将点好试样的薄层板放入色谱器中进行展开，点样的位置必须在展开剂液面之上，当展开剂上升到薄层的前沿（离前端 510mm）或多组分已明显分开时，取出薄层板放平晾干，用铅笔划溶剂前沿的位置后，即可显色。20图4 点样211.4.4显色 如

13、果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。如果本身无色，可先在紫外灯光下观察有无荧光斑点（有苯环的物质都有），用铅笔在薄层板上划出斑点的位置；对于在紫外灯光下不显色的，可放在含少量碘蒸气的容器中显色来检查色点（因为许多化合物都能和碘成黄棕色斑点），显色后，立即用铅笔标出斑点的位置。 图5显色221.4.5用 TLC跟踪有机反应 在同一块板上点上原料样和反应混合物样（均需配成稀溶液），按上述方法进行展开和显色，记下原料样的斑点位置和反应混合物样中相应斑点的位置和大小。过一定时间后，再取反应混合物样液点样、展开、显色，如发现反应混合液样中相应于原料斑点的位置处，无斑点或斑点变小，则说明反应已经完成

14、或接近完成，所以依此可跟踪有机化学反应。这在有机合成上很有意义。23 2 柱 色 谱 柱色谱也叫柱层析分离,就是常说的过柱子。柱色谱按分配原理不同分为吸附色谱和分配色谱两种。吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂;分配色谱以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收较大量的液体作为固定相.我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。 2.1 吸附柱层析的原理： 混合样品在淋洗剂携带下流经吸附剂反复多次的吸附-解吸溶解 过程极性较大溶解度较小的组分在柱中走过较长的距离,出来的较晚.242.2 柱色谱装置 柱色谱装置包括色谱柱、滴液漏斗、接受瓶。 色谱柱有玻璃制的和有机玻璃制的，后者只用于水做展开剂的场合。

15、色谱柱下端配有旋塞，色谱柱的长径比应不小于7-8:1。 图5 柱色谱252.3 吸附柱层析的材料选择2.3.1层析柱 材料：玻璃，塑料薄膜，不锈钢 尺寸：经长比1:81:50；最常用的约为1:15 细长：分离效果好，但时间长，分离量小，用于分离较难分离的样品 短粗：分离效果差，但可在较短时间内分离较多样品，用于较易分离或分离程度要求不高的样品2.3.2 吸附剂 选择原则：大体同薄层层析，只是粒度略粗，一般氧化铝约150 目，硅胶约60100目，不用粘合剂 用量：一般为样品重量的3050倍，难分离的样品可达100倍26 常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。一般多用氧化铝，商品有

16、专供色谱用氧化铝.氧化铝的活化有IV五级，I级的吸附作用太强，V级的吸附作用太弱。所以一般常采用II，III级。 2.3.3 溶质的结构和吸附能力 化合物的吸附性和它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团其吸附性较强。氧化铝对各种化合物的吸附性按下列顺序递减。 酸、碱醇、胺、硫醇酯、醛、酮芳香族化合物卤代物、醚烯饱和烃。272.3.4 溶解试样的溶剂 试样溶剂的选择是重要的一环，通常根据被分离化合物中各种成 分的极性、溶解度和吸附剂活性等来考虑： （1）溶剂要求较纯，如氯仿中含有乙醇、水分及不挥发物质，都会影响试样的吸附和洗脱。 （2）溶剂和氧化铝不能起化学反应。 （3）溶剂的极性应比

17、试样极性小一些，否则试样不易被氧化铝吸附。 （4）溶剂对试样的溶解度不能太大，否则影响吸附；也不能太小，如太小，溶液的体积增加，易使色谱分散。 （5）有时可使用混合溶剂，如有的组分含有较多的极性基团，在极性小的溶剂中溶解度太小，也可先选用极性较大的溶剂溶解。而后加入一定量的非极性溶剂，这样既降低了溶液的极性，又减少了溶液的体积。282.3.5 淋洗剂 也叫洗脱剂，即流动相。 试样吸附在氧化铝柱上后，用合适的溶剂进行洗脱，这种溶剂称为洗脱剂。如果原来用于溶解试样的溶剂冲洗柱子不能达到分离的目的，可改用其他溶剂。一般极性较大的溶剂影响试样和氧化铝之间的吸附，容易将试样洗脱下来，达不到将试样逐一分离

18、的目的。因此常使用一系列极性渐次增大的溶剂。为了逐渐提高溶剂的洗脱能力和分离效果，也可用混合溶剂作为过渡。先用薄层选择好适宜溶剂。常用洗脱溶剂的极性按以下次序递增。 己烷、石油醚环已烷四氯化碳三氯乙烯二硫化碳甲苯苯二氯甲烷三氯甲烷乙醚乙酸乙酯丙酮丙醇乙醇甲醇水吡啶乙酸292.4 吸附柱层析的操作要点2.4.1 装柱（湿法） （1）称取适量的吸附剂（中性氧化铝），在小烧杯中用淋洗剂调成糊状 （2）竖直安装层析柱，注入约1/4容积的淋洗剂 （3）取少量脱脂棉，用溶剂润湿，挤出气泡，推至柱底（不要塞得太死） （4）旋开活塞，控制1滴/ 秒流速，在搅拌下加入糊状物，同时轻敲柱身（用洗耳球） （5）加盖

19、滤纸片（或白沙），关活塞，上扣小烧杯 （6）注意：不许流干，装成的柱子应无气泡、无断层，装载面平整。 干法装柱：是在管的上端放一干燥漏斗，使氧化铝均匀地经干燥漏斗成一细流慢慢装入管中，中间不应间断，时时轻轻敲打柱身，使装填均匀，全部加入后，再加入溶剂，使氧化铝全部润湿。另外也可先将溶剂加入管内，约为柱高的四分之三处，而后将氧化铝通过一粗颈玻璃漏斗慢慢倒入并轻轻敲击柱身。此法较简便。 302.3.2 加样：（1）开活塞，1d / Sec.（2）液面隆至滤纸片，贴壁加入混合样液0.51ml（要求均匀加样）（3）液面再降至滤纸片，沿加样处冲洗柱壁每次约0.5m1，每次都要使 液面隆至滤纸片（4）至柱

20、壁无色时方可加入大量淋洗剂淋洗 2.3.3淋洗和接收：（1）保持流速1d / See（2）换接收瓶 无色溶剂第一色带空白带第二色带无色溶剂（3）接收色带最浓处12滴供薄层鉴定用31 在洗脱和分离的过程中，应当注意： 连续不断地加入洗脱剂，并保持一定高度的液面，在整个操作中勿使氧化铝表面的溶液流干，一旦流干，再加溶剂，易使氧化铝柱产生气泡和裂缝，影响分离效果。收集洗脱液，如试样各组分有颜色，在氧化铝柱上可直接观察。洗脱后分别收集各个组分。在多数情况下，化合物没有颜色，收集洗脱液时，多采用等份收集，每份洗脱剂的体积随所用氧化铝的量及试样的分离情况而定。一般若用50g氧化铝，每份洗脱液的体积常为50

21、mL。如洗脱液极性较大或试样的各组分结构相近似时，每份收集量要小。 要控制洗脱液的流出速度，一般不宜太快，太快了柱中交换来不及达到平衡，因而影响分离效果。由于氧化铝表面活性较大，有时可能促使某些成分破坏，所以应尽量在一定时间内完成一个柱色谱的分离，以免试样在柱上停留的时间过长，发生变化。 322.3.4 后处理： 氧化铝（用洗耳球）挤入废物桶，不可倒入水槽中 层析柱（不洗）竖直夹在铁架台上 有色溶剂、无色溶剂分别回收2.4操作评定标准： 装柱情况（装载面，气泡，断层等） 柱中分离情况（色带前沿清晰，水平，空白带宽，过渡带狭窄，无倾斜或 局部前伸）33 3 凝 胶 色 谱凝胶层析又称分子筛过滤、

22、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。但它也有自己的缺点,其中最主要的是它的峰容量较小以及不能分离具有相同或非常相似大小的分子3.1分离的基本原理： 主要根据溶液中分子体积（流体力学体积）的大小形象的来看，犹如对溶液中所有的组分按分子体积大小进行过筛，在很多情况下有独特的分离效果343.2 实验器材的选择：3.2.1凝胶的选择: 根据实验目的不同选择不同型号的凝胶:（1）如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于

23、它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50; （2）对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4;（3）如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。353.2.2凝胶柱尺寸的选择: 柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱;分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-

24、5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。3.3 操作说明:3.3.1凝胶柱的制备:（1）凝胶溶胀: 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。36（2）凝胶的填装:将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头

25、液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。373.3.2加样和洗脱:凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5-10。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2。样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱