多组学联合验证,肠道微生物失调与虾白便综合症的因果关系终揭开

1、多组学联合验证，肠道微生物失调与虾白便综合症的因果关系终揭开美格基因很多人喜欢吃虾，丰富的蛋白质，鲜甜的口感，肥嫩多汁入口即享受。但是，当你享受着这些饕餮美食的时候有想过它们也许携带着病毒，也许正面临着严重的威胁。在Microbiome期刊上有这样一篇文章，通过多组学关联网络，揭示了虾类WFS与微生物群落结构、功能潜力及IM代谢密切相关。可以这样说，威胁全球虾类存亡，导致虾白便综合症的原因之一终于找到了。该研究使用了16S扩增、宏基因组学以及代谢组学技术联合的方法，从生态学角度了解了新的水生动物致病机理，为将来的研究提供了参考，下面一起来欣赏吧。原标题：MicroecologicalKochs

2、postulatesrevealthatintestinalmicrobiotadysbiosiscontributestoshrimpwhitefecessyndrome柯赫氏法则揭示肠道微生物失调导致虾白便综合症作者：ZhijianHuangz3,4*,ShenzhengZeng1,4,JinboXiong5,DongweiHou1,RenjunZhou1,ChengguangXing2,DongdongWei1,XishaDeng1,LingfeiYu1,HaoWang2,ZhixuanDeng1,ShaopingWeng2,3,SatapornvanitKriengkrai6,Dali

3、angNing7,JizhongZhou7andJianguoHe1,2,3,4*期刊：Microbiome时间：2020IF：10.465DOI：10.1186/s40168-020-00802-3一、研究背景及结果1、背景近来很多研究表明，一些复杂疾病并不只是单一病原体造成的，而是由宿主肠道微生物(intestinalmicrobiota,IM)群落的失调引起。白便综合症(whitefecessyndrome,WFS)是一种严重威胁全球虾类的非传染性疾病，它与肠道微生物的改变有关，但还没有实验对此进行验证。作者综合利用16S扩增子、宏基因组和代谢组分析及肠道微生物移植(intestinal

4、microbiotatransplantation,IMT），对IM和WFS之间的因果关系进行了探索。2、结果与健康虾相比，WFS病虾的微生物丰度及多样性急剧降低，10个属的细菌如Vibrio、CandidatusBacilloplasma、Photobacterium及Aeromonas在病虾中富集，而健康虾中富集的是其他11个属的微生物，包括Shewanella、Chitinibacter和Rhodobacter等。病虾微生物群落的改变会削弱硫辛酸代谢和矿物质吸收途径。像脂类和有机酸这样的一系列代谢物与WFS病虾的IM改变有关。通过多组学关联网络，我们揭示了虾类WFS与微生物群落结构、功能

5、潜力及IM代谢密切相关。饮食补充实验确定了导致IM失调的代谢产物。此外，接受WFS微生物移植的健康虾最终也表现出了WFS的病症，而接受健康虾IMT则可以恢复病虾的肠道群落，饲料中添加代谢产物可以导致IM失调。二、实验设计1、虾样本及其IMT:选取平均体长9cm的虾，分别获取健康虾和WFS病虾的肠道IM,再移植到其他虾中，同时以移植PBS作为对照。2、饮食补充代谢物：选择在WFS病虾中富集的且与细菌相关的9种代谢物用以饮食补充，喂养一周后取虾肠道进行IM分析。3、测序和代谢分析：提取虾肠道DNA并进行16SrRNA（V4区）和宏基因组测序；使用LC/MS技术对虾肠道样本进行代谢组分析。4、分子生

6、态网络分析：对健康组和病虾组的物种互作关系进行分析，找出其中的关键物种。5、群落组装机制研究：对健康组、病虾组、IMT组和对照组的细菌群落组装机制进行分析，比较各个生态过程在不同组的贡献度。三、实验结果1、WFS症状和组织病理学WFS病虾活动减弱、停止摄食，排出的粪便为白色，病虾中肠膨大且充满白色内容物，而健康虾的中肠则是棕色且里面是粪便（图1a）。病虾的肠道上皮细胞脱落，微绒毛减少或消失，中肠也较薄（图1b）。2、健康虾和WFS病虾的IM组成比较、功能变化及代谢特点对75个健康虾样本和84个WFS病虾样本进行测序，共得到12024种OTU,分类到了61个门、1135个属。病虾的a多样性显著低

7、于健康虾（图1c），且两类虾的细菌群落明显不同（图1d）。WFS样本的PCoA中心距离显著高于健康组（图1e），说明病虾IM群落结构的均匀度低于健康虾。D4神*删柑0.0fil.fi-|气！疋肋盧_QvWu理F吕GnlioiW-FSa.cjaaPCI忖图1WFS病虾的症状、组织病理及微生物特点10个纟田菌属女口Vibrio、CandidatusBacilloplasma、Photobacterium、Aeromonas等在WFS病虾中富集，而在健康虾中富集的是其他11个属的微生物，包括Shewanella、Chitinibacter及Rhodobacter等（图1f）。将167种OTU作为疾病

8、的biomarkers，基于这些markers可计算出病虾的疾病概率指数（probabilityofdiseaseindex,POD）远高于健康虾，该指数在此的正确率达99.4%（图1g）。从7个健康虾样本和6个WFS病虾样本中共得到68.9Gb的宏基因组数据，KEGG数据库评估结果表明这2组虾的IM功能结构存在巨大差异（图2a）。病虾的13条代谢途径，如矿物吸收、硫辛酸代谢等显著减少，而涉及细菌趋化、溶酶体、鞭毛组装等14条代谢途径则有所增加。KEGG注释结果表明健康虾和病虾的代谢存在显著差别（图2b），LC/MS实验中两组差异巨大的代谢成分有35种，包括胆酸、石胆酸、亚油酸、肉豆蔻酸、大豆

9、苷元及大豆黄素等。甲.0TLW&7图2健康虾和病虾中微生物基因功能和代谢模式比较3、微生物组、宏基因组和代谢组的整合35种代谢产物和21类细菌属之间存在显著的关联。健康组中富集的Chitinibacter与十种代谢产物如胆酸、苯乙胺等正相关，而与九种代谢物如癸二酸和琥珀酸等负相关。患病组中富集的Vibrio与十种代谢产物如油酸、癸二酸、琥珀酸等正相关。与最多致病属都相关的代谢物是癸二酸和琥珀酸，它们可能是引发WFS的重要物质。Vibrio和Lactobacillus与聚酮、氨基酸和甾醇脂类显著相关，而CandidatusBacilloplasma及Chitinibacter与脂肪酰和甘油胆碱存

10、在联系（图2c），以上4类细菌和Rhodobacter都是在网络分析中与其他物种联系最紧密、和疾病相关的核心物种。4、IMT和移植前后的IM特点将病虾的IM移植到30只健康虾中（C+W1）（图3a），其中的11只出现了典型的WFS症状（图3bc），而移植PBS（C+P1）和健康虾（C+C）IM的虾并无任何WFS症状。将病虾的IM滤液（C+WF）移植到健康虾中也不会引起WFS，说明病毒与该疾病无关。将C+W1组的6只病虾作为第二次IMT的供体，30只健康虾分别移植IM（C+W2）和PBS（C+P2），前者导致8只虾患病（图3d），而移植PBS的虾不患病。有趣的是，30只病虾在移植健康虾IM（W+

11、C）后，13只恢复了健康（图3e）。以上结果证明WFS和IM失调确实存在因果关系。图4新患病虾的IM失调CuifcjrRderMJubswuE：HJ1图3IM移植导致WFS相似症状的出现tY刑iLOP1Y的”1十加d目J2asrioHcHjrtCJC)NounC+W1和C+W2组的a多样性明显低于C+P1和C+P2组（图4a），且前两组和WFS组明显聚类到了一起（图4b）。致病菌属Vibrio、Photobacterium、CandidatusBacilloplasma及Aeromonas在C+W1和C+W2组的丰度很高，而Shewanella、Chitinibacter、Rhodobacte

12、r在C+Pl和C+P2组中更少（图4d,e）。以上模式与健康虾和病虾IM组成的改变是一致的（图1）。此外，WFS与健康组中富集的属彼此间负相关（图4f）。接受健康虾IM移植后，病虾的IM的a多样性增加，群落组成也与健康组相似。病虾的POD值非常高（图4c），这也证明了IM失调是导致WFS的因素。rs-1-CwWC+P1C+Wi芒zEqaiConsolWF-3C+P1CA1REncfeK*i73rmenGAscaecum低阳心比密阳中reimicfiPh|fciHri.!Jcrt(Cfr&.fy1Ci_Lk-HEKWlJtiTt-W!htoTP.Fgb忙忸中Otw、-cflnfcve5、饮食补充

13、的代谢物与IM失调有关用9种代谢物分别喂养虾一个星期。辛酸、肉豆蔻酸、N-乙酰-D-氨基葡萄糖的补充使IM的Shannon指数显著降低。十五烷酸和油酸的补充增加了Vibrio的丰度，而癸酸、石胆酸等增加了CandidatusBacilloplasma的丰度。与此相反，辛酸、十五烷酸、癸酸等降低了健康组中Shewanella的丰度，前两者还让Chitinibacter的占比也大幅下降了。代谢物补充组明显比对照组的POD值要高很多。总之，这些代谢物是虾类IM结构的决定因素，即饮食营养直接关系着虾的健康。6、健康虾和WFS病虾中的分子生态网络网络图有利于了解物种互作关系（图4g）。与健康组IM相比，

14、患病组的平均物种关联性低，连接路径长，说明物种的互作更少也更复杂。健康组的核心node是Proteobacteria，而WFS组的则是另外一个包含Bacteroidetes和Chloroflexi的门。患病组网络图中Vibrio、Shewanella、CandidatusBacilloplasma及Chitinibacter是与周围物种联系最密切的4个枢纽。7、生态过程的贡献比较比较各组的ses.MNTD值的大小，与健康虾相比，疾病虾的肠菌组装中的确定性过程减弱，随机性过程增加（图5）.通过Nullmodel分析，疾病虾的同质选择过程和异质选择过程的贡献度显著降低（图6）。图5生态过程的贡献比

15、较StochasticDetermiristic6%11%C十氏HeterogeneousselectionHomogeneousselectionDispersallimiitationDrift图6生态过程的贡献比较四、小结与亮点本研究综合利用多组学和代谢组学，比较了健康虾和WFS病虾的肠道微生物群落情况，以及IMT实验和代谢物补充对WFS的影响。结果表明，WFS病虾的肠道功能损伤，IM结构失调，大量富集疾病相关微生物，如Vibrio、CandidatusBacilloplasma、Photobacterium及Aeromonas等10个属，而缺少了健康虾中富集的Shewanella、Chitinibacter和Rhodobacter等11个属。IMT实验也证实了IM群落的结构决定着虾的健康。而9种代谢物的补充会改变IM结构，从而导致WFS的发生，说明了饮食营养对于虾类健康的重要性。总之，本研究利用多组学和实验验证（图7），从生态学角度了解了新的水生动物致病机理，为将来的研究提供了参考。琵带karph昌呼嗣*yRnmaMlGTDbKrtjdDKJ5QflV)ft.echtiir.HGBH-LzeddyMiniEKmicrobkitjcomjpGEibKHiremains刖加口比(TJ柯口