静脉移植脂肪来源干细胞治疗大鼠脑缺血模型的实验研究

1、本项目为湖南省卫生厅科研基金课题，课题编号（A2004-002）*通讯作者：刘运海，中南大学湘雅医院神经内科，410008，E-mail:静脉移植脂肪来源干细胞治疗大鼠脑缺血模型的实验研究王玮1 张宁1 杨兴东2 刘运海1 1中南大学湘雅医院神经内科，湖南 长沙 410008 2北京海淀医院，北京，100083The Therapeutic Effect Of The Intravenous Administration Of Adipose-derived Adult Stem Cells For Treating Transient Focal Cerebral Ischemia In R

2、ats Wang-Wei 1, Zhang-Ning 1, Yang Xingdong 2, Liu Yunhai11Department of Neurology ,Xiangya Hospital of Central South University,Changsha,410008，China2Beijing Haidian Hospital,Beijing, 410008 , ChinaAbstract AIM: TO observe the survival ,migration,differentiation and the recovery of neurological ded

3、icits after transplantation of ADSCs into ischemic rats.And we also explored the effectiveness of ADSCs transplantation in treating the middle cerebral artery occlusion of Sprague-Dawley rats, and the potential therapeutic time window. METHODS: Adult male SD rats were subjected to middle cerebral ar

4、tery occlusion by the monofilament method.DMEM were transplanted to control group at 3,6,12,24,72 hours after MCAo respectively. About 3*106ADSCs in 1ml prelabeled with BrdU were transplanted transplantation group by venous approach at above-mentioned time. These animals were euthanized at 14 days a

5、fter MCAo. Immunofluoresecence for BrdU,NSE,MAP-2,GFAP were processed to assess neurological functions,TTC staining was used to examine the volumes of cerebral infactions. The apoptotic neurons in ischemic areas were observed by terminal deoxynucleotidyl transferrase-mediated d UTP nick end labeling

6、 (TUNEL)staining . RESULTS: 1.After transplantation, ADSCs labeling with BrdU were present in the ischeminc points and surrounding areas ,while very few BrdU positive cells could be found in the counterlateral hemisphere.2.the percentages of BrdU that labeled expressed BrdU/GFAP, BrdU/NSE, BrdU/MAP-

7、2-positive cells were separedtely 6.9%.1.1% and 1.3% in the ischemic points at 14days after ischemia. 3.In ADSCs transplantation group ,neurological functional recocery were improved significantly at 14days compared with untreated group and control group at the same time points, the scores of motor

8、severity of the rats in 3-h postlesion group was the lowest ,the difference was evident between that in 3-h postelesion group and 72-h postlesion group.4. ADSCs transplantation at all of these time ppints resulted in lesion volume reduction,the infarct lesions were the fewest when ADSCs were intrave

9、nously administrated 3h after MCAo,there is obvious difference compared with that of 72h postlesion group .5.TUNEL-positive cells around the ischemic lesions in ADSCs transplantation group were significantly fewer compared with untreated group and control group at the same time points(P0.05),and the

10、 number of TUNEL-positive cells around the ischemic lesions in ADSCs transplantation group at the same time points (P0.05),and the number of TUNEL-positive cells in the rats in 3h postlesion group was the lowest, the difference was evident between that in 3h postlesion group was the lowest ,the diff

11、erence was evident between that in 3h postlesion group and 72h postlesion group. CONCLUSIONS: 1.ADSCs could migrate into ischemic hemisphere by venous approcach in the MCAo model in the rat ,and express the neuron and the glial cell marks.2.The intravenous administration of ADSCs into rats with MCAo

12、 lead to greater functional outcome and fewer lesion size,The therapeutic effects of inravenous administration of ADSCs in rats afer MCAo may contribute to that it can significantly decrease TUNEL-positive neurons in the MCAo model in the rat.3.There is potential therapeutic time window for intraven

13、ous administration of ADSCs in rats after MCAo.The earlier transplantation times after the ischemic insult resuled in more beneficial outcomes ,but the infarct volume in rats transplanted even at 72 h afer MCAo was limited compared with the control lesioned rats ,and that these rats showed improved

14、behavioral function also.Key words adipose-derived stem cells ;focal cerebral ischemia ; therapeutic time window；vein graft；Immunofluorescence摘要 目的：观察ADSCs移植入脑缺血大鼠后细胞的存活、迁移、分化以及大鼠的神经功能缺损恢复情况，探讨ADSCs移植治疗治疗大鼠局灶性脑缺血的有效性和潜在的治疗时间窗。方法: 制作成年雄性SD大鼠MCAO模型，未处理组手术后不作特殊处理，DMEM干预各组分别在术后第3、6、12、24、72小时经左侧股静脉注射DME

15、M lml; ADSCs移植各组分别在上述5个时间点静脉给予ADSCs 1ml，各组大鼠于MCAo术后14天处死。免疫荧光染色观察BrdU, NSE, MAP-2和GFAP的表达;第3、7及14天对动物进行神经功能评分;TTC染色法测定脑梗死体积，TUNEL染色观察缺血区神经元凋亡变化。结果：1、ADSCs移植后主要分布在脑缺血灶周围，而非缺血侧大脑极少分布;2、ADSCs移植组缺血灶周围BrdU/GFAP, BrdU/NSE和BrdU/MAP-2双染阳性细胞比例分别为6.9%、1.1%和1.3%; 3、7、14天时各ADSCs移植组大鼠神经功能缺损评分与未处理组或同时间点对照组相比有显著性降

16、低(P0.05)，而3h组神经功能评分最低，与72小时组相比有显著性差异(P0.05); 4、ADSCs移植组的脑梗死体积明显小于未处理组或同时间点DMEM处理组(P0.05)，而3h组脑梗死体积最小，与72h组相比有显著性差异(P0.05);5、 ADSCs移植组的细胞凋亡数目明显少于未处理组和同时间点DMEM处理组(P0.01)，而3h组凋亡数目最小，与72h组相比有显著性差异(P0.01)。结论：、静脉移植在脑内能迁移分布到梗死灶周围，能表达神经元和星形胶质细胞标志物、静脉抑制能改善大鼠缺血所致的神经功能缺损，减少脑梗死体积。、静脉移植治疗MCAo大鼠存在治疗时间窗，早期移植改善作用更为

17、明显，MCAo后小时移植仍然有效。关键词 脂肪基质干细胞；脑缺血；治疗时间窗；静脉移植；免疫荧光中图号 R743.32O引言脑血管病是严重威胁人类特别是中老年人生命和健康的一类疾病，是目前人类疾病的三大死亡原因之一。而缺血性脑血管病占脑血管病的75%左右，并且面对缺血性脑血管病的高死亡率和高致残率，当前的治疗手段效果甚微。过去认为脑神经细胞一经坏死则不能再生，当前的治疗方法亦立足于抢救濒临坏死的脑细胞和通过促进其余存留的脑细胞的代偿来改善神经功能缺损，而对于己坏死的脑细胞则别无良策，这亦是当前缺血性脑血管病高死亡率和高致残率原因的根本所在。脂肪干细 胞(adipose-derived adul

18、t stem cell, ADSCs)从脂肪组织中获得，它们具有干细胞的特性，能够自我增殖并分化成多种谱系的细胞1.2.3，新近的研究发现，ADAS在体外诱导分化后可变为神经样细胞，并能够表达神经细胞特有的信号4.5.6，我们也在前期的研究中发现脑梗死侧的脑组织上清液也可以诱导脂肪干细胞发育成神经细胞。并且 ADSCs是一种易于获得、对病人创伤小、易于产生足够的细胞数目、无需长时间培养、能够减少移植后的自体免疫应答、且无法律和伦理限制的自体细胞，新近的研究将其推向组织工程和再生医学的前沿。本实验通大鼠脑缺血模型的ADSCs移植，观察ADSCs移植入脑缺血大鼠后细胞的存活、迁移、分化以及大鼠的神

19、经功能缺损恢复情况，探讨ADSCs1材料和方法1.1材料 1.1.1实验动物及分组：清洁级健康成年雄性SD大鼠（中南大学动物部, 鼠龄 6 - 8周，体重280-320g），采用SD大鼠左侧大脑中动脉线拴模型方法,闭塞90分钟后再通,MCAo术后随机分为11组（每组18只），第一组为未处理组，26组对照组，711组为移植组。各组动物在手术前均禁食1214小时，可自由饮水。未处理组手术后常规饮食，不作特殊处理，对照组分别在MCAo术第3、6、12、24、72小时后通过左侧股静脉注射DMEM；移植组分别在上述5个时间点静脉给予ADSCs1ml1.1.2主要试剂：100mL/L水合氯醛（中南大学药剂

20、科），型胶原酶，胰酶（Sigma），DMEM低糖（GIBCO/BRL），胎牛血清（Hcylone），小鼠抗MAP-2、抗GFAP单克隆抗体（Neomarkers），小鼠抗NSE(Serotec)、小鼠抗CD34 （Santa Cruz），小鼠抗CD44 （Serotec），小鼠抗CD29 （Biolegend）。 1.2 方法1.2.1 细胞培养及形态学观察 100mL/L 水合氯醛(3 mL /kg) 腹腔注射麻醉SD大鼠，无菌条件下取出腹股沟处脂肪，剔除软组织和小血管，PBS 缓冲液冲洗3 次，剪成小块，37下7.5g/L型胶原酶消化30min，含15%FBS 的DMEM 等体积中和，10

21、00 转/min 离心10min 后弃去上清及脂肪组织，160mmol/L 红细胞裂解液裂解红细胞10min，离心弃去上清，含15g/LFBS 的DMEM重悬细胞及沉淀的组织快，接种至含血清培养基的培养瓶。每72h换液1次，810d细胞生长至亚融合状态时胰酶消化，离心收集。细胞融合至80%一90%的ADSCs用含0.02%的EDTA的0.25%胰蛋白酶消化(于镜下控制消化时间)，细胞稀释2-3倍传至培养瓶中培养，观察细胞生长情况，待细胞基本融合，再用胰酶消化，以上述方法进行细胞传代扩增培养。取第25代细胞，漂洗，离心,戊二醛固定，漂洗，锷酸固定，丙酮梯度脱水，环氧丙烷置换，树脂浸透，1.2.2

22、 动物模型制作以线栓法2制作大鼠MCAO模型。10%的水合氯醛(0.3ml/100mg)腹腔注射麻醉大鼠后，分离右颈总动脉并剪一小口，将头端烧成光滑杵状的国产尼龙线(直径0.235mm，长6cm)插入，以颈总动脉分叉处计算进线深度为180.5mm，至大脑中动脉起始部以完全阻断血供。模型成功的标志是麻醉苏醒后大鼠出现前肢或后肢瘫痪，并在造模24h后行头部MRI检查确定造模成功。24hT1 W1显示MCA区的稍低信号（稍长T1信号），T2WI及水抑制系列均显示MCA区的异常高信号（长T2信号），与周围正常组织对比明显，提示存在缺血损伤病灶。ADSCs悬液1ml（3 106 个细胞/mL ）(细胞移

23、植前与Brdu 共培养24 h)按照0.1ml/秒的速度将1ml细胞悬液全部推注入大鼠左侧股静脉内。 1.2.3 脑缺血大鼠神经功能缺损评分 脑缺血2小时待动物清醒后，参照Chen等的方法进行神经运动功能评分。具体评分:提尾时：前肢屈曲1分，后肢屈曲1分，30秒内头部垂直运动10度1分（以上三项可以累计）；行走时:正常行走0分，不能走直线1分，向瘫痪侧旋转2分，倒向瘫痪侧3分。按照上述标注于再灌注后3、7和14天对动物行为障碍的程度进行评分，0分作为模型不成功剔除，并在后续实验中补充前面剔出出组的动物，保证每组6只实验动物。1.2.4 组织学检查 按时间点捕杀动物，过量麻醉，40 g/L多聚甲

24、醛灌注固定后取脑组织, 常规行固定、脱水、透明、浸蜡及包埋，切片，厚度为20微米。TCC染色和脑梗死体积测定：将切片置于TCC磷酸缓冲液中避光, 37度恒温孵育30min,正常组织红染,不显色部分为脑梗死组织.甲醛固定24小时后用数码相机拍照,应用HPIAS-1000病理图文分析系统测定各层面积及脑梗死面积。Brdu染色标记其存活及迁移途径：PBS冲洗，盐酸，胰酶, TritonX-100,各处理30min,加入小鼠抗Brdu（1:100），4摄氏度过夜，冲洗，加Fitc标记IgG（1：200），封片，观察。按Tunel试剂盒方法检测细胞凋亡：切片脱蜡后用蛋白酶K37 消化20min，冲洗后加

25、入3 g/L H2O2(甲醇溶解)之后，1 g/L TritonX-100处理,PBS洗2次，凉干滴加10 L反应液 (1 L酶和9 L反应缓冲液混匀)置于湿盒37 60 min。依次加入凋亡试剂盒的Buffer A,显色剂，bufferB，显色剂。之后，DAB复染20 s，水洗,脱水，透明，封固。显微镜下1.2.5 统计学分析全部资料采用SPSS 11.0软件包分析，各组数据均用s 表示：多组样本均数间比较先用方差分析，再用q检验，p0.05表示有显著性差异。2 结果2.1 细胞形态学观察 原代细胞培养3天可见少量细胞贴壁，6天左右细胞开始成集落样生长，形态呈梭型及不规则三角型，9天左右集落

26、相互融合，逐渐形成亚融合态。电镜显示ADSCs核呈分叶状，染色质丰富，胞浆内细胞器不发达，呈低分化状态，符合原始细胞特点。2.2运动功能评价 各组大鼠在MCAo术后3天神经功能评分最高,进行统计学分析发现:14天时各ADSCs移植组大鼠神经功能缺损评分与未处理组及同时间对照组相比有显著性降低(P 0.05) ,而在各ADSCs移植组中以3小时组神经功能评分最低,与72小时组相比有显著性差异(P0.05),如表1所示.表1 各组大鼠神经功能缺损评分的影响（s）组别例数3d7d14d未处理（MCAo组）1组243.330.522.80.362.020.43对照组（DMEM处理组）2（3h）243.

27、450.772.780.63 2.000.223（6h）243.530.452.740.721.920.304（12h）243.420.662.820.431.950.305（24h）243.350.502.450.522.000.386（72h）243.390.592.790.571.950.31ADCS干预组247（3h）243.500.492.420.341.070.408（6h）243.370.572.450.671.370.219（12h）243.430.512.510.371.400.2610（24h）243.440.622.400.531.470.3311（72h）243.660

28、.562.430.651.560.34与未处理组比较P0.05，与同时间点对照组比较P0.05，与7组比较P0.05。2.2 TTC染色观察及脑梗死体积测定 TCC染色显示非梗死侧脑组织红染，而缺血侧发现有局限的不显色区域（白色），与周围和对侧非缺血区脑组织（红染）界限较分明，后缺血区主要位于视交叉后2-4mm脑皮质，各组用数码相机拍照，在各组脑组织冠状切面上，TCC染色应用HPIAS-1000病理图文分析系统测量各层面积，计算脑梗死体积（结果见表2 ）。结果发现：各移植组大鼠脑梗死体积与未处理组及同时间点对照组相比有显著性降低（P0.05），在各移植组中又以3小时组脑梗死体积最低，与72小时

29、组相比有显著性差异（P0.05）表各组大鼠脑梗死体积的比较（mm3, s）组别例数脑梗死体积未处理（MCAo组）1组6178.1722.87对照组（DMEM处理组）2（3h）6147.3337.403（6h）6149.1740.604（12h）6152.1741.105（24h）6169.6733.996（72h）6174.3330.22ADCS干预组67（3h）696.6723.148（6h）6101.6727.149（12h）6108.0025.4810（24h）6121.5023.4611（72h）6133.3331.68与未处理组比较P0.05，与同时间点对照组比较P0.05，与7组比

30、较P0.01)，ADSCs移植组的细胞凋亡数目明显少于未处理组和同时间点对照组（p0.01），ADSCs治疗各组中以3小时以至组凋亡细胞数最低，与72小时移植组相比有显著性差异（P0.01）见表3 。 表各组大鼠梗死周围区域凋亡细胞数目的比较（个，s）组别例数凋亡细胞数未处理（MCAo组）1组650.504.84对照组（DMEM处理组）2（3h）647.505.163（6h）656.006.814（12h）653.336.685（24h）651.174.366（72h）654.334.93ADCS干预组67（3h）621.673.338（6h）634.175.719（12h）633.175.9

31、810（24h）639.834.9611（72h）641.676.74与未处理组比较P0.05，与同时间点对照组比较P0.05，与7组比较P0.05。 3 讨论 干细胞具有自我更新能力,能够向神经细胞分化,在局灶性脑缺血性损伤的治疗中可能起重要作用。已经有研究发现当脑内出现损伤信号时,骨髓干细胞可向脑缺血病灶迁移,将骨髓干细胞移植入缺血脑组织后,这些细胞发生迁移和分化,并减轻卒中后的神经功能缺损0。而脂肪干细胞具有和骨髓干细胞类似的特性, 日前已经证实脂肪组织来源干细胞能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导转化11.12，13.14.15，可作为多种组织工程的种子细胞。新

32、近研究发现，从大鼠腹部摘取的脂肪组织在体外纯化并大量扩增后体外定向诱导。大部分ADSCs细胞转变为表达NSE的神经元样细胞，并有轴突和树突样结构出现，多个神经元样细胞之间可形成网络。显示在一定培养条件下，来源于脂肪组织提取物的细胞有分化为神经样细胞的能力11,16-20 因此本研究将ADSCs经尾静脉移植入脑梗死大鼠模型，发现通过静脉移植的ADSCs能够穿透血脑屏障并迁移至缺血脑组织周围,并且ADSCs主要迁移分布在脑梗死区域，在非梗死区域可检测到极少量的标记的ADAS。有研究表明化学归巢因子可能促使移植的干细胞向脑缺血区域迁移。据报道21 ，大鼠局灶性脑缺血后，缺血脑组织内的单核细胞化学趋化

33、蛋白一1 (monocyto chemoattractant protein-1 , MCP -1)明显升高;体外研究发现，缺血脑组织提取物能促进骨髓基质细胞(MSCs)的迁移而加用抗MCP- 1抗体后，MSCs的迁移明显受抑。说明炎性化学趋化因子MCP-1可促进MScs的迁移并分布至脑缺血部位。此外，巨噬细胞炎性蛋白一la(macrophage inflammatory protein-lalpha , MIP-la)， 白介素一8(interleukin-8,IL-8)等炎性化学趋化因子及炎性细胞因子也有促进MSCs在缺血脑组织内的迁移的作用22 。有报道发现ADSCs有着一些与骨髓基质细

34、胞同样的细胞粘附分子和受体分子，ADSCs的蛋白表达谱与。RNA与骨髓基质细胞相似23 ，表明ADSCs在组织工程学与再生医学领域可能有着与骨髓基质细胞相似的潜力，因此上述化学因子可能也对ADSCs同样有“招募”作用。同时对各组大鼠神经功能缺损评分发现：各移植组大鼠脑梗死体积与未处理组及同时间点对照组相比有显著性降低（P0.05），在各移植组中又以3小时组脑梗死体积最低，与72小时组相比有显著性差异（P0.05），这说明静脉移植ADSCs能改善大鼠脑缺血所致的神经功能缺损，减小脑梗死体积。ADSCs促使神经功能改善及缩小梗死体积的具体机制目前仍然不十分明确，目前有以下两种观点:一是移植的细胞可

35、以迁移至缺血区域并替代受损的脑组织:二是增加神经生长因子的分泌来实现。本实验发现移植后14天虽然有大量的Brdu阳性的细胞聚集在缺血区域周围，但是仅有大约2.4%和6.9%植入干细胞表达神经元和神经胶质细胞的标志物，不足以完全替代损伤的神经细胞构成神经反射回路起到代偿功能;因此尽管ADSC移植治疗后表达神经细胞的蛋白表型，我们仍然不能认为这些细胞确实分化并替代了受损的脑组织，细胞移植治疗产生效果更可能的机制是减少缺血半影区的细胞凋亡、增加神经生长因子的分泌来实现。当前对ADSCs治疗缺血性脑损伤移植时间点的选择也颇有争议，Mampalam等 认为移植时问应选择在MCAo后2-15天进行，另一些

36、学者则认为3周时脑组织较为适合移植物的生长，也有一些学者认为3周时再行NSC移植己不能逆转缺血后继发的丘脑萎缩24.25。Satoshi等则在不同时间点对MCAo动物模型移植BMSCs后发现存在明显的组织学和动物行为学上的差异，而以早期移植效果最佳26 。本研究发现3小时移植组与其它时间点移植组相比能够获得更明显的神经功能改善，一方面，考虑不同缺血损伤后的不同时程，神经元的活力和状态不一样，随着时间的推移，越来越多的神经细胞将发生不可逆损害，所以早期移植更利于保护缺血半影区脑组织，缩小缺血半影区体积;另一方面，一些凋亡因子，如Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，在凋亡过程中尤

37、其是缺血所致的凋亡过程中起着关键性的作用。值得注意的是我们的研究结果表明早期移植效果较好，然而即使是72小时移植组与同时间点的对照组相比仍然获得了神经功能的改善和缺血体积的缩小。尽管目前多种供体细胞都作为卒中治疗的细胞来源，脂肪干细胞仍以更多的优势吸引着研究者的目光:取材容易，取材量大，能反复取材，损伤较小，能保持稳定的倍增能力和低水平的衰减，体外扩增简单易行，因此极有可能会成为多种疾病治疗的新替代细胞源。参考文献1Huang J I ,Beanes SR ,Zhu M ,et al.Rat extramedullary adipose tissue as a source of osteoc

38、hondrogenic progenitor cells ,Plast ReconstrSurg,2002,109:1042-1043.2Zuk PA,Zhu M ,Ash jian P,et al.Human adiose tissue is a source of multipotent stem cells ,Mol.Biol ,Cell 2002,13:4279-4295.3Toma C ,Pittenger MF ,Cahill 4Safford Km,Hicokke,Safford SD,et al .Neurogenic differentiation of murine and

39、 human adipose-derived stromal cells,Biochem Biophys Res,2002,294:371-379.5Ashjian PH,Elarbary AS6Safford KM.Safford SD ,Gimble JM.et al.Characterization of neuronal/glial differentiation of murine adipose-derived adult stromal cells ,Experimental Neurology.2004,187:319-328.7JinHK ,Carter JE,Huntley

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