转化酶的测定

1、转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它 能将植物体内的主要同化产物一一蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮 库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶 联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的 转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。试剂：1、10%蔗糖溶液2、葡萄糖标准液(500p g/ml)3、0.05mol/l的磷酸缓冲液4、(DNS) 3，5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH溶液，加到 500ml含有185g酒石酸

2、钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却 后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。方法：1、酶的提取：1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml， 在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。2、酶活性的测定：吸酶液2ml,放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶 液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3, 5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。 以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定标准曲线：取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准

3、液：管号123456葡萄糖原液量(ml)00.40.81.21.62.0加蒸馏水量(ml)2.01.61.20.80.40葡萄糖浓度(p g/ml)0100200300400500在上述各管中分别加入1.5ml 3, 5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立 即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml，混匀，以1号管为空白，测540nm 波长下的OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml反应液，加入1.5ml 3, 5二硝基水杨酸试剂， 沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml，测定540nm波长下的OD值，查标准

4、曲线得酶反 应液中还原糖的浓度。4、结果计算：A=(N-N)*V/(T*W*1000)A：转化酶的活性(mg/gfw/h)N：酶反应液中还原糖的浓度(p g/ml)N：钝化酶反应液中还原糖的浓度(p g/ml) V：酶反应液的总体积T：反应时间W：材料鲜重方法：1、酶的提取：1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml, 在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。2、酶活性的测定：吸酶液2ml，放入试管中（以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照）， 加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即吸取 2ml

5、加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml，测定540nm 波长下的OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度：Y 3 g/ml）=744.63*OD值3、结果计算：A=Y*V/（T*W*1000）（一般范围 1440mg/g/fw/h）A：转化酶的活性（mg/gfw/h）Y :上式计算得酶反应液中还原糖的浓度（pg/ml）V：酶反应液的总体积100mlT：反应时间0.5hW：材料鲜重（fw）一个处理3次重复所需试验台仪器：容量瓶（100ml）刻度试管（20mlx4，1个对照），移液管（5mlx1，2mlx1，1 ml x1），研钵试剂：10%（w/v）蔗糖

6、溶液现用现配：称取10g加入用蒸馏水定容至100ml.。葡萄糖标准液（500 g/ml）： 80度烘干葡萄糖0.05克蒸馏水定容100ml。PH=5.4,5%的磷酸缓冲液：Na2HPO4 - 12.H2O0.448125g, NaH2PO4 - 2H2O 3.731125g,加水 溶解定容至250ml.（DNS） 3，5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l或20.96gNaOH溶液， 加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚（即苯酚）和5g亚硫酸钠， 搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。预冷蒸馅水1000ml.（一个

7、处理，3次重复）1g左右样品1份，剪碎1F预冷的蒸馏水研磨成匀浆1 F蒸馏水定容至100ml1 r冰箱中浸提至少3小时*混均，倒入4个离心管，在4000转离心15分钟】r分别吸2ml上清液，放入4个试管1 r其中任选1个试管煮沸至少10分钟作对照，此后（包括煮沸10分钟的对照试管）各试管加PH6.0的缓冲液5ml，10%蔗糖溶液1m】r37度水浴中保温30分钟取出后分别加入1.5ml 3, 5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟1 r取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温加蒸馏水定容至20ml,540nm比色(读数即为OD值)转化酶的测定10%(w/v)蔗糖溶液现用现配：称取10g加入用蒸馏水定容至100ml葡萄糖标准液(500g/ml)：葡萄糖标准液:80度烘干葡萄糖0.05克蒸馏水定容100ml。PH=5.4,5%的磷酸缓冲液:Na2HPO4 12.H2O0.448125g, NaH2PO4 - 2H2O 3.731125g,加水 溶解定容至250ml.(DNS) 3, 5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和