呕吐毒素标准检测规程完整

1、呕吐毒素标准操作规程1、目的为了规亲和柱净化样本中呕吐毒素的操作流程，特制订本操作规程2、围本标准适用于粮食、饲料、食品中呕吐毒素的检测。3、检出限和定量限项目岛津安捷伦样本检出限(pg/kg)样本定量限(pg/kg)样本检出限(yg/kg)样本定量限(pg/kg)DON12.9636.721515034、_职责部门名称部门职责质量管理部1、负责本制度的实施。2、负责本制度的监督执行。5、程序5.1原理测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过呕吐毒素免疫亲和柱，在免疫亲和柱毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用中醇洗脱呕吐毒素，然

2、后注入到分析仪器中用于检测。5.2溶液配制PBS缓冲液:称取&0g氯化钠，l2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL蒸镭水或去离子水溶解，用浓盐酸调节pH至7.0,再用蒸憎水或去离子水定容至1L。上述PBS缓冲液用于样品的提取、稀释，以及亲和柱的清洗。5.2.2呕吐毒素标准工作液：先用色谱级中醇将高标稀释到5ppm,再用水将其稀释到lppm,此时标品的溶剂为20%中醇，然后再用20%HJ醇将标准品梯度稀释到500ppb、200ppb、lOOppbx50ppb。5.3样品前处理玉米、小麦、面粉、配合饲料、浓缩料、精补料等吸水性较小的样本将样品粉碎，称取25g样品，加入5g

3、聚乙二醇，加入125mL蒸镭水：高速均质(10,000r/min)lmin(或用摇床200r/min300r/min居lj烈振荡20min)；-用快速定性滤纸过滤，收集滤液；-滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；取25mL上样液过免疫亲和柱净化。稀释倍数：25.3.2隸皮、豆皮、玉米胚芽粕、米糠等吸水性较强的样本一称取10g样品，加入1OOmL蒸憎水；高速均质（10,000r/min）lmin（或用摇床200r/min300r/min剧烈振荡20min）；-用快速定性滤纸过滤，收集滤液；-滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；取5mL上样液过免疫亲和柱净化。稀释倍数：25.3

4、.3酒类-取脱气的酒类样品（含二氧化碳的酒类样品，使用前先搅拌或超声脱气）或不含二氧化碳的酒类样品25g,用PBS缓冲液定容至100mL；高速均质（10,000r/min）lmin（或用摇床200r/min一300r/min剧烈振荡20min）；-用快速定性滤纸过滤，收集滤液；-滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；取2mL上样液过免疫亲和柱净化。稀释倍数：25.3.4酱油、醋、酱及酱制品取样品25g，用PBS缓冲液定容至lOOmL；高速均质（10,000r/min）lmin（或用摇床200r/min300r/min剧烈振荡20min）；-用快速定性滤纸过滤，收集滤液；-滤液再用微纤维

5、滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；-取2mL上样液过免疫亲和柱净化。稀释倍数：25.4净化取出免疫亲和柱，将上方塞子取出斜剪断，再插回亲和（3mL的免疫亲和柱去掉上方塞子，安装上转接头，将转接头另一端与注射器固定后使用）-将柱子与气控操作架上的注射器连接固定，取适量处理后的洛液上样；-去掉亲和柱下方堵头，调节开关，使液体以12滴/秒的速度流出；待液体排干后，方法5.3.1中的样品用蒸镭水或去离子水洗涤2次，每次10mL,其余样品首先用O.l%Tween-2O水溶液洗涤10mL，再用蒸镭水或去离子水洗涤10mL,流速23滴/秒；待液体排干后，上样ImL甲醇，流速1滴/秒，收集洗脱液并在5060C加

6、热条件下N2气吹干，然后用ImL流动相（20%屮醇）复溶；复溶液用022pm微孔滤器过滤后转移至样品瓶中用于HPLC分析。*每次上样前都要将上次液体完全排干。5.5液相测定5.5.1液相色谱条件C18柱：250mm（长）x4.6mm（直径），填料粒径5pm；流动相：20%甲醇流速:1.0mL/min；柱温：40C；进样体积：50pL紫外检测器：218nm5.5.2色谱定量分别取相同体积样液和标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积），以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，将未知样本中呕叶毒素的峰面积带入标准曲线，得到试样中呕吐毒素的浓度，标准品色谱

7、图参考下图：IQO0ClmV附图：DON-SOOppb标准品液相图谱CON60CdejUOHpigDON50go使用前，免疫亲和柱需回至室温（2225C）。注意事项亲和柱28C储存，不得冻存。-不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。-取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量，注意提取液量要相应改变。柱容量：2000ng，当样本中待检毒素的含量除以稀释倍数高于柱容量时，需要适当降低上样液的体积，重新检测。-pH：亲和柱的上样溶液pH需在68之间，若偏离此围需要用盐酸或氢氧化钠调节pH。由于样本中呕吐毒素的含量普遍较高，如果计算后样本含量大于4mg/kg时，表示已经超过亲和柱柱容量，需要适当降低上样液的体积，重新检测。-上机检测时的溶剂与流动相保持致可以消除洛剂效应的影响。-呕吐毒素可致癌，应戴手套操作。-使用过的容器及标准品溶液最好用次氯酸钠溶液（5%V/V）浸泡过夜。6、相关文件免疫亲和柱检验